新型冠状病毒标本热灭活处理对血清学检验项目结果的影响
陈文华1,毋崇岭2△ ,郑 荣1,张 玲1,高 黝1,何宝明1
陕西省汉中市中心医院:1.检验科;2.脊柱外科
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)传染力强,人群普遍易感,新型冠状病毒肺炎(COVID-19)是由SARS-CoV-2感染引起的一种肺部感染性疾病,目前,该病尚无针对特异性治疗药物。国家卫生健康委员会将COVID-19纳入乙类传染病,并按甲类传染病进行预防和控制 [1]。由于COVID-19患者血液、体液标本具有潜在传染性,实验室检测人员存在职业暴露可能,给实验室检测人员带来极大的心理压力和较高的院感防控风险 [2]。
有研究指出SARS-CoV-2在56℃30min处理可被灭活,但标本灭活后哪些项目不受影响,哪些项目可以参考使用,哪些项目坚决不可以灭活尚不清楚[3-4]。为此,本研究通过对同一患者的两份标本作56℃30min热灭活与未灭活处理后所检测结果进行分析,旨在探讨标本经56℃30min热灭活处理后,是否对COVID-19诊疗方案过程中要求的常用监测指标检测结果产生影响。
1资料与方法
1.1 一般资料
选取2020年1-12月在陕西省汉中市中心医院采用陕西浏阳三力医用科技有限公司的负压真空采血管(黄帽管)采集的SARS-CoV-2筛查标本95例(每例标本均双管采集,3.0mL),标本来源于门诊、感染科、肿瘤科、内风湿科等科室。其中男68例,女37例,年龄22~70岁。排除感染性、凝血障碍性等疾病志愿者。
1.2 仪器与试剂
日立7180全自动生化分析仪(简称日立7180)及厂家配套试剂盒,质控品(病理水平和正常水平)为美国伯乐公司生产;德国罗氏有限公司电化学发光设备(简称Cobase801)及厂家配套试剂、质控品(阴性和弱阳性质控)。欧蒙公司试剂盒,奥林巴斯荧光显微镜;重庆博奥赛斯科技生物有限公司磁微粒化学发光法检测设备(简称Axceed260)及厂家配套试剂、质控品(阴性和阳性);脱帽离心机型号LXJ-IIC(上海安亭科学仪器厂)、恒温水浴箱型号HH-S6(山东博科科学仪器有限公司)。
1.3 标本处理
收集95例双管临床标本,将每例标本中的一管室温放置30min,作不灭活处理(未灭活组);另一管置于HH-S6恒温(56℃)水浴箱作热灭活处理30min(灭活组)。两管标本同时进行1500×g离心10min,收集上清液,待测。
1.4 检测方法
1.4.1 常规生化项目检测在日立7180上同时对两组标本进行丙氨酸氨基转移酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、总蛋白(TP)、尿素(Urea)、肌酐(Crea)、二氧化碳总量(TCO2)、钙(Ca)、氯(Cl)、胆固醇(CHOL)、三酰甘油(TG)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌钙蛋白T(cTnT)、葡萄糖(Glu)和超敏C-反应蛋白(hs-CRP)共15个常规生化项目检测。
1.4.2 发光项目检测在Cobase801上采用电化学发光法同时对两组标本进行传染病指标[乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、丙型肝炎病毒抗体(HCV-Ab)和艾滋病病毒抗体(HIV-Ab)]、肿瘤标志物[甲胎蛋白(AFP)和细胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)]、炎症因子指标[降钙素原(PCT)和白细胞介素-6(IL-6)]和甲状腺激素[促甲状腺激素(TSH)、三碘甲状腺原氨酸(T3)和甲状腺素(T4)]共10个发光项目检测,检测结果以定量形式报告。
1.4.3 自身抗体检测采用间接荧光免疫法以手工加样方式同时对两组标本进行抗核抗体(ANA)和抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)检测,在奥林巴斯荧光显微镜下判读其核型和滴度的结果。
1.4.4 SARS-CoV-2抗体检测在Axceed260上采用磁微粒化学发光法同时对两组标本进行SARS-CoV-2的IgM和IgG抗体检测,结果以S/CO=标本发光值/cut-off表示。标本结果S/CO<1.0判为阴性;结果S/CO≥1.0判为阳性。以上项目检测前,其室内质控均在控。检测过程严格按照相关专业组的标准操作规程执行,由具有丰富经验并考核过关的人员负责操作。
1.5 统计学处理
采用SPSS20.0软件进行统计分析,比较灭活组与未处理组检测结果的差异。计量资料用x±s表示,两组间比较行t检验;计数资料采用百分比(%)表示,两组间比较行χ2检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
2结果
2.1灭活组和未灭活组常规生化项目检测结果比较灭活组检测ALT、ALP、TCO2、CK和CK-MB结果低于未灭活组,差异均有统计学意义(P<0.05)。灭活组检测TP、Urea、Crea、Ca、Cl、CHOL、TG、cT-nT、Glu和hs-CRP结果与未灭活组检测结果比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。
ALT、ALP和CK-MB在灭活组和未灭活组间具有相关性(r值分别0.997、0.976和0.778,P<0.05),TCO2和CK在灭活组和未灭活组间无相关性(P>0.05),见表2。
2.3灭活组和未灭活组化学发光法检测项目的结果比较
灭活组检测T3、T4和CYFRA21-1结果低于未灭活组,差异均有统计学意义(P<0.05)。灭活组检测HBsAg、HCV-Ab、HIV-Ab、AFP、PCT、IL-6和TSH结果与未灭活组检测结果比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3。
2.4灭活组和未灭活组自身抗体检测结果比较
77例ANA阴性标本和77例ANCA阴性标本,灭活组和未灭活组均呈阴性结果,一致性为100%。18例ANA阳性标本中,5例核颗粒阳性,6例为核均质,3例胞浆颗粒型,2例核点型标本,2例核仁型标本;18例ANCA阳性标本中,11例抗中性粒细胞胞浆抗体核周型(pANCA),7例抗中性粒细胞胞浆抗体胞浆型(c-ANCA)。灭活组标本荧光核型未发生改变,荧光强度也未发生变化。阳性标本在灭活处理后结果均为阳性,阳性结果符合率为100%,Kappa值=1>0.75,一致性好。见图1。
2.5灭活组和未灭活组SARS-CoV-2抗体检测结果比较
灭活组和未灭活组SARS-CoV-2IgM和IgG抗体检测结果比较,差异均无统计学意义(P>0.05),见表4。95例患者血标本中,SARS-CoV-2IgM和IgG抗体检测均阳性的有3例,未灭活组血清SARS-CoV-2IgM抗体检出2例阳性,47例阴性;SARS-CoV-2IgG抗体检出1例阳性,43例阴性。灭活组血清SARS-CoV-2IgM抗体检出2例阳性,46例阴性;SARS-CoV-2IgG抗体检出1例阳性,43例阴性。灭活组和未灭活组血清SARS-CoV-2IgM和IgG抗体检测结果阴阳性符合率为100%。
3讨论
SARS-CoV-2感染患者的诊断、鉴别诊断及治疗过程中要监测常规生化、传染病、肿瘤标志物、炎症因子等血清学指标,以及尿液、粪便等体液。如果不作任何处理,就开展相关血清学指标进行检测,极易因职业暴露增加医护人员感染风险。除了做好生物安全防护外,在不影响检测结果的前提下,若能在检测前将标本进行热灭活处理,将极大降低医务人员感染的概率。因此,评估临床标本经热灭活处理后是否影响COVID-19诊疗工作开展就显得极为重要。
常规生化检测项目是疾病监测的最常规的基础指标,是COVID-19诊疗方案中明确提出的监测指标[5-6]。本研究对15项常规生化指标进行检测发现,灭活组TP、Urea、Crea、Ca、Cl、CHOL、TG、cTnT、Glu和hs-CRP检测结果与未灭活组检测结果比较,差异均无统计学意义(P>0.05),提示可采用56℃30min热灭活方式处理标本。灭活组ALT、ALP、CK和CK-MB检测结果低于未灭活组,差异均有统计学意义(P<0.05)。
这结果与刘长德等 [7] 和郭旺源等[8]学者的研究结果一致,认为这些酶学指标均为不耐热酶,56℃加热30min处理影响了酶的活性。目前临床标本在56℃30min热灭活处理下稳定性还存在一定的争议,还需要更大数据的支持。灭活组TCO2检测结果低于未灭活组,差异有统计学意义(P<0.05),与文献[9]研究结果一致。说明加热可引起血清中CO2丢失,同时与标本采集、运输及上机时间也有很大关系。
针对标本热灭活处理后对部分酶学项目及TCO2检测的影响,文献[10]建议对灭活前后的数据进行直线回归分析,得到回归方程和相关系数,以便于校正后消除影响可参考使用。本研究对上述5个指标回归分析发现,ALT、ALP和CK-MB在灭活组和未灭活组间具有相关性,说明这3个项目的检测结果进行校正后可参考使用。但TCO2和CK在灭活组和未灭活组间无相关性,预示这两个项目的检测结果无法进行校正后使用。
文献[11-12]证实,对疑似或确诊COVID-19患者在各项手术前、侵入性操作前、输血前均需要对传染病、肿瘤标志物、炎症因子等检测,便利于病情监测和治疗,以及排除其他潜在感染因素,减少医务工作人员的职业暴露,避免医源性感染的发生。目前,传染病指标、肿瘤标志物、炎症因子等检测,通常采用免疫反应结合化学发光测定技术即电化学发光免疫分析技术(ECLIA)进行检测,ECLIA具有检测速度快、线性范围宽、特异度强、灵敏度高等特点。
本研究灭活组T3和T4检测结果低于未灭活组,差异均有统计学意义(P<0.05),与毕东明等[13]研究结果相一致。这说明热灭活可能对T3和T4的抗原抗体结合位点、蛋白质活性或免疫原性产生一定的影响,但目前研究数据尚小,还需要多中心大数据研究来进一步证实。灭活组CYFRA21-1检测结果低于未灭活组,差异有统计学意义(P<0.05),与文献[14]研究结果相一致。
CYFRA21-1是一种可溶性酸性多肽的细胞角蛋白19的片段,主要出现在肺部,为非小细胞肺癌的首选生物标志物,常常释放到癌症患者血清中被检测出,推测是由于高温变性导致蛋白或蛋白结合位点变性,使结果有显著差异。灭活组HBsAg、HCV-Ab、HIV-Ab、AFP、PCT、IL-6和TSH检测结果与未灭活组检测结果比较,差异均无统计学意义(P>0.05),与孙晶晶等[15]和王辉等[16]研究结果一致,证明上述指标的抗原抗体结合位点、蛋白质活性或免疫原性不受热灭活的影响,灭活组和未灭活组该指标检测结果具有较好的一致性。故在疫情期间用热灭活处理标本不影响这些项目的检测结果,可以监测病情,从而有效保护医护工作者。
间接荧光免疫法
本研究采用的间接荧光免疫法检测ANA和ANCA,结果提示灭活组和未灭活组ANA及ANCA阴阳性符合率、不同滴度、不同核型阴阳性符合率不受影响,但上述研究尚需进一步验证。
SARS-CoV-2抗体检测是COVID-19筛查的重要手段,56℃30min热灭活可以有效避免接触人员感染SARS-CoV-2。灭活组标本采用磁微粒化学发光技术对SARS-CoV-22项抗体进行检测是目前重要的检测方法。本研究对血清SARS-CoV-2IgM和IgG抗体进行检测,结果发现,95例标本灭活组和未灭活组SARS-CoV-2IgM和IgG抗体检测结果比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。
灭活组和未灭活组血清SARS-CoV-2IgM和IgG抗体检测结果阴阳性符合率为100%,与薛雄燕等[17]研究结果一致,但与刘小政等[18]研究结果有一定差异,分析其原因可能是方法学的不同导致的,其研究采用胶体金方法检测。所以在进行标本热灭活处理前除了关注检测项目本身、标本类型外,还需要关注同一个检测项目的方法学,以保障检测质量。
检验科常用项目进行56℃30min热灭活,在血清学项目中常规生化项目除TCO2、少量不耐热的酶类ALT、ALP、CK、CK-MB受较大影响外,其他项目均不受影响。发光检测项目中传染病指标、肿瘤标志物、炎症因子等不受影响,甲状腺激素中T3、T4还需要进一步加大数据验证其是否受热灭活的影响。
自身抗体检测ANA和ANCA灭活前后核型和荧光强度一致性为100%,SARS-CoV-2抗体检测的结果也不受56℃30min热灭活影响。因此,在疫情期间建议对疑似SARS-CoV-2感染患者开展诊治时,应对其标本进行热灭活处理,以保证检测结果质量,同时可降低院内感染及防控的风险。
本研究不足之处:本研究完全模拟日常检测流程,检测过程中的随机误差因素未能进行有效的控制。同时由于实验室的条件限制,因此热灭活处理的效果降低实验室检测生物安全压力的程度尚不能完全评估。
参考文献
[2] 梅俊华,张琦,龚雪,等.医护人员感染新型冠状病毒肺炎后心理及睡眠状态分析[J].医药导报，2020.39(3):345-349.
[4] CHAN J F, YUAN S,KOK K H,et al. A familial cluster of pneumonia associated with the 2019 novel coronavirus indicating person-to-person transmission: a study of a family cluster[J]. Lancet,2020,395(10223):514-523.
[5]董宏杰,张俊梅,王帅,等.新型冠状病毒混合样品检测研究[J].山东大学学报(医学版),2021,59(4):1-5.
[6]陈炜,张春阳,朱颖,等.4例新型冠状病毒感染病例咽拭子与痰标本病毒核酸检测的比较[J].中国人兽共患病学报,2020,36(5):354-358.
[7]刘长德,焦明远,高超,等.血清56℃加热 30 min 灭活对生化指标检测结果的影响研究[J].国际检验医学杂志，2020,41(11):1366-1370.
[8]郭旺源,汤敏,史文元,等.56℃30min 灭活对新型冠状病毒抗体和生化免疫检测结果的影响[J].检验医学与临床,2021,18(1):97-100.
[9]李天志,徐国纲.新型冠状病毒肺炎诊治研究进展[J]解放军医学杂志,2020,45(3):260-264.
[10] TOIKKA PIRJALA K,JUVEN T,et al. Serum procalcitonin,C-reactive protein and interleukin-6 for distin guishing bacterial and viral pneumonia in children[J].Pediatric Infect Dis J.2000,19(7):598-602.
[11]朱耐伟,赵平,戚中田.2019新型冠状病毒肺炎治疗研究现状[J]中华微生物学和免疫学杂志2020,40(1):7-10.
[12]程家国,谭晓东,张玲,等.新型冠状病毒肺炎确诊患者及隔离留观者心理状况的影响因素研究[J].护理管理杂志,2020,20(4):247-251.
[13]毕冬明,张欣,杨雪,等.56℃30min灭活标本后对肿瘤标志物和激素相关指标检验结果及存储稳定性的影响[J].检验医学与临床,2020,17(21):3165-3167.
[14]姜蕾,张丽媛,刘大宁.两种灭活方法对 2019 新型冠状病毒咽拭子标本病毒核酸检测结果的影响[J].分子诊断与治疗杂志,2020,12(4):410-413.
[15]孙晶晶,刘纯,杨增伟,等,血清加热灭活法对新型冠状病毒肺炎患者的降钙素原和白细胞介素-6 检测结果的影响研究[J].兰州大学学报(医学版),2020,46(2):10-13.
[16]王辉,金鑫瑶,庞博,等.中医药于预新型冠状病毒肺炎临床研究方案分析[J]中国中药杂志，2020,45(6):1232-1241.
17薛雄燕,朱嫦琳,黄少珍,等.血液样本灭活处理对三种SARS-CoV-2抗体检测方法结果的影响[J].南方医科大学学报,202040(3):316-320.
[18]刘小政，苑庆华,夏斌新,等新型冠状病毒IgG和IgM抗体检测的诊断价值探索[J]医学食疗与健康202119(1):146-148.
编辑：姜旭
审阅：管佩钰
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