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1、抗中性粒细胞胞浆抗体(A NCA)检测及临床意义间接荧光免疫(I I F)方法(欧盟)一、ANCA概念及分类抗中性粒细胞胞浆抗体就是一种以中性粒细胞与单核细胞胞浆成份为靶抗 原得自身抗体，对系统性血管炎炎症性肠病等多种疾病得诊断与鉴别诊断具有重要 得意义，己成为自身免疫性疾病得一项非常重要得常规检测项目。目前，己经有十余种中性粒细胞胞浆成分被证实为ANCA得靶抗原,蛋白酶 3( P R3),髓过氧化物酶(M P O),人口细胞弹性蛋口酶(HEL),乳铁蛋口 (L F ),组织蛋 白酶G (C a山G),杀菌/通透性增强蛋白(B PI),人溶酶体相关膜蛋白2 (H-L AMP2), 溶菌素(LY
2、S),天青杀素,防御素，烯醇化酶，葡萄糖醛酸酶、根据乙醇固定得中性粒细胞基质片中，可以区分两种不同得荧光模型：一种胞浆型(c-ANCA),就是均匀分布在整个中性粒细胞胞浆中得颗粒型荧 光，细胞核无荧光。在乙醇与甲醛固定得中性粒细胞片中,其荧光模型表现相同。其 主要得靶抗原就是蛋白酶3( P R3)。另一种就是核周型(pANCA),就是围绕中性粒细胞细胞核周围得平滑带状 荧光。由多种抗原引起注要靶抗原就是髓过氧化物酶(MPO),人口细胞弹性蛋白酶 (HEL),乳铁蛋白(LF),组织蛋口酶G(Ca t h G),杀菌/通透性增强蛋白(B PI),人溶酶 体相关膜蛋口 2(11 LAMP2),溶菌素
3、(LYS)等。不同抗体在乙醇与甲醛固定得中 性粒细胞片中，其荧光模型表现有所不同、抗MPO抗体产生得p-ANCA因耐甲 醛,其荧光模型与在乙醇固定得中性粒细胞中出现得c-ANCA类似故叫甲醛抗 性得p-ANCAo而其她非MPO抗体不与甲醛固定得中性粒细胞反应，无荧光表 现,这种类型又称为甲醛敏感得P ANCA、故根据乙醇与甲醛固定得中性粒细胞 片表现，可初步判定ANC A得靶抗原PR 3 ,MPO,非MPO三类。二、ANCA得检测间接荧光免疫方法就是检测ANCA得参考方法或者标准方法,至今也就是最常用得经典方法、I I F就是区分c-ANCA与p-ANCA得基础，有较高敏感性，可 半定量，但I
4、 IF测定得就是总ANC A,不能准确区分靶抗原，需特异性得检测方法 作为补充。由于多种免疫性疾病患者存在ANA,用IIF法检测ANCA时，会产生干扰实验结区分ANA得干扰:H e p2细胞有典型荧光表现，Hep-2细 胞甲醛固定 粒细胞1:判断cANCA,2:区分 pANCA对 甲醛敏感还 就是耐受甲醛抗性p-AN C A:抗M P 0抗体 耐甲醛，其荧光与在乙醇固左得中 性粒细胞中得c-ANCA类似甲醛敏感p-ANCA淇她非M PO 抗体不与甲醛固泄得中性粒细胞 反应，无荧光表现区分ANA与ANCA:借助猴肝细 胞与英中得肝血窦粒细胞。AN CA阳性,只有肝血窦粒细胞 出现荧光,。如果两者
5、同时阳性，所 有肝细胞核都有荧光。猴肝 细胞乙醇固左 粒细胞就是标准实验基质、区分两种荧光模型:c-ANCA ;p-ANCA果得判断。为避免干扰现象，采用了四基质联合得检测即:乙醇固定得粒细胞;甲醛固定得粒细胞；Hep-2（人喉癌细胞）细胞;猴肝细胞。基质片各细胞分布及意义如表一所 述。ANCA荧光模型及表现如表二所述。表一:四联基质片分布及意义表二:ANCA荧光模型及表现荧光模型荧光表现乙醇固泄粒细胞甲醛固左粒细胞Hep-2细胞猴肝细胞ANA 阴 性cANCA阳性胞质呈现弥散得细颗 粒荧光，胞质荧光淸 晰勾勒岀核得轮廓， 分页核之间荧光增 强。胞质呈现弥散得细颗 粒荧光，胞质荧光淸晰 勾勒出
6、核得轮邮，分页 核之间荧光增强。阴性肝细胞本身无荧光。 仅肝血窦粒细胞出现 荧光。p-ANCA阳性甲醛 耐受 p-AN CA呈现核周胞质平滑丝 状带荧光。荧光阳性 得胞质主要集中在分 页核周围，形成环状胞质呈现弥散得细颗 粒荧光，胞质荧光淸晰 勾勒出核得轮廓，分页 核之间荧光增强。阴性肝脏细胞本身无荧光。 仅肝血窦粒细胞岀现 荧光。或不规则得块状、甲醛 敏感P ANCA呈现核周胞质平滑丝 状带荧光、荧光阳性 得胞质主要集中在分 页核周围，形成环状 或不规则得块状。阴性阴性肝脏细胞本身无荧光、 仅肝血窦粒细胞岀现 荧光、AN A 阳 性ANCA阴性细胞核阳性,荧光强 度增强阴性细胞核呈现 荧光表
7、现，如ANA所述肝细胞核阳性、 肝血窦粒细胞未见荧 光。甲醛耐受p-AN CA阳性细胞核阳性,荧光强 度增强荧光表现如c-ANCA 阳性,乙醇,甲醛固定 粒细胞所述细胞核呈现 荧光表现，如 ANA所述、肝细胞与肝血窦粒细 胞都有荧光。甲醛敏感p-A NCA阳性细胞核阳性,荧光强 度增强阴性细胞核呈现 荧光表现，如 ANA所述、肝细胞与肝血窦粒细 胞都有荧光。三、注意事项为提高对疾病诊断得特异性，检测时应注意以下问题1、检测AN C A,般建议同时做IIF初筛与确认实验,以提高ANCA得临床应用 价值，不做单独初筛或单独确认实验，以免降低对疾病诊断得特异性。2、不能仅检测抗PR3与MPO两种特异
8、性抗体，而不检测,这样容易限制ANCA 对疾病诊断得特异性、3、用IIF检测时，仅使用乙醇固定得粒细胞片，这样不能严格排除ANA得干扰，容 易出现假阳性。四、临床意义(一)ANC A与原发性小血管炎韦格纳肉芽肿(WG),显微多动脉炎(MPA),坏死性新月体性肾小球肾炎(NCG N)与变应性肉芽肿性血管炎(CSS)等等原发性系统性小血管炎得发病与ANCA 密切相关,临床上己将上述疾病统称为ANCA相关小血管炎。ANCA,特异性PR3 抗体与抗MPO抗体得检测己成为原发性小血管炎得敏感特异得血清学检测项目。1、抗PR3抗体特异性PR3抗体为WG得标志性抗体，抗PR3抗体荧光模型以c-ANCA为 主
9、。但以c-ANC A诊断WG特异性为9 0%,而以抗PR3抗体得特异性可超过9 5%。 抗PR 3抗体在其她得原发性血管炎中业可以检测出来，但阳性率较低。抗PR3抗体敏感度与疾病得活动性及病程有关，在疾病得早期症状不明显时, 就可出现阳性、因而抗PR3抗体常作为WG得早期诊断、疗效判断、复发估计得 指标，对临床治疗有重要得参考价值。2、抗MPO抗体抗MPO抗体荧光模型以pANCA为主注要与MP A、NC GN、CSS相关。 还可见于其她疾病，如节结性多动脉炎，抗肾小球基底膜肾病,WG,SLE,RA,药物诱 导得狼疮,Felt y综合症等。抗体滴度与疾病活动性相关，可用于早期诊断、疗效 判断、复
10、发估计得指标，对临床治疗有重要得参考价值。抗MPO抗体阳性高度提示坏死性血管炎或特发性NCGN,对诊断原发性小血 管炎得特异性达到9 9%。因而每一个不明原因得血管炎或肾小球肾炎得患者，都应 该检测ANCAo表三:ANCA与原发性小血管炎相关疾病荧光模型靶抗原()韦格纳肉芽肿(WG)C ,P(少见)PR3(85),MPO(1 0 )显微多动脉炎(MPA)C,pPR3(45),MPO(4 5)坏死性新月体性肾小球肾炎(NCGN)c ,P(少见)PR3(25),MPO(65)变应性肉芽肿性血管炎(CS S )c ,P(少见)PR3(10),MPO(60)结节性多动脉炎(PAN)少见PR3(5),M
11、PO(15)抗肾小球基底膜病(抗G BN)PMPO(二)ANCA与药物诱导性血管炎近年来不断有药物治疗引起得ANCA阳性得病例报道，如丙基硫氧卩密噪，腓 苯哒嗪，普鲁卡因酰胺,青酶胺，美满霉素,她巴哇/甲疏咪哇等、其中报道比较多得就 是长期使用丙基硫氧喀噪引起得ANCA,其特点就是滴度高，抗体谱广(抗原主要就 是MPO,也可同时伴有或单独出现其她靶抗原，如PR3丄F,C a th G,BP I ,LYS等)。药物诱导性血管炎患者临床表现与原发性血管炎类似，停止丙基硫氧喘唳用药 后,临床症状好转,ANCA可转阴、因此,长期使用丙基硫氧咗噪治疗过程中，应定期 检测ANCA,及早发现药物诱导性血管炎
12、、(三)ANCA与其她疾病除原发性血管炎外，其她一些疾病中也可出现ANCA,主要为p-AN C A,其靶 抗原并非PR,MPO,而就是LF,C a t h G,BP I , L Y S等1、慢性炎症性肠病(CIBD)CIBD就是一种消化系统得自身免疫性疾病，包括溃疡性结肠炎(UC),克罗 恩病(CD)两种。以往得C I BD诊断依赖X线检查，内窥镜及组织学诊断，缺乏有效 得试验室指标。近年来研究发现UC病人血清中ANCA阳性率为6 080%,而 CD患者得阳性率为10-20%,多为p-ANCA,相关靶抗原有BPI等。滴度与疾病得活 动度与病程无关。因为P 一ANCA在UC阳性率高,CD阳性率低，故可作为两者得 鉴别诊断及U C早期诊断指标。2、结缔组织病在结缔组织病中,ANCA阳性主要见于SLE与RA,其她结缔组织病中少见。 但文献报道在S L E与RA阳性率差异特别大(1 6 6 9%),这可能与使用方法，抗原 基质片及工作人员水平有很大关系。SLE中ANCA阳
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