免疫组化实验步骤及方法

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实验步骤详解：

1，取 材

颈椎脱臼法处死小鼠，打开腹腔，剪取所需的组织，切取的组织块不宜太大，以利于固定剂穿透。

注意取材动作要迅速，不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化，切片材料应根据需要观察的部位进行选择，尽可能不要损伤所需要的部分。

2，切片制备

(1)固定

将切好的组织(<5mm3)用生理盐水组织洗一下，立即投入4%多聚甲醛(PFA)或10%中性福尔马林(NBF)中固定，根据组织大小和松密程度室温4-48h。若取材是小鼠大脑或神经组织，可以采用灌流的方式进行固定。

(2)洗涤

材料经固定后,水或酒精(若采用含有苦味酸的固定剂bouin，就用酒精洗涤)冲洗，数小时或过夜，目的是去除组织内固定液及结晶沉淀。

(3)脱水

目的是因为透明剂多是苯类，苯和水不互溶，用到的材料是酒精，将组织依次经70%、80%、90%各级乙醇溶液脱水，各30min，再放入95%、100%各2次，每次20min。

(4)透明

由于乙醇与石蜡不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蜡，所以脱水后还要经过二甲苯以过渡。当组织中全部被二甲苯占有时，光线可以透过，组织呈现出不同程度的透明状态。一般是用纯酒精、二甲苯等量混合液浸润材料1-2h，再换纯透明剂(二甲苯、苯、氯仿、正丁醇)。

(5)浸蜡和包埋

透蜡的目的是除去组织中的透明剂(如二甲苯等)，使石蜡渗浸到组织内部达到饱和程度以便包埋。先放入二甲苯和石蜡各半的混合液，再放入熔化的石蜡中浸润，透蜡时间根据组织大小而定。浸蜡之后放入包埋盒用石蜡进行包埋。

(6) 切片

通常切片厚度为4-6um，蜡切片刀的锐利与否、蜡块硬度是否适当，直接影响切片质量。

(7)贴片与烤片

目的是用粘附剂将展平的蜡片牢附于载玻片上，以免在以后的脱蜡、水化及染色等步骤中滑落。先在洁净的载玻片上涂抹薄层蛋白甘油，蜡片于温水中(45°C左右)中展平，捞至玻片上铺正，将载玻片放入45℃温箱中干燥。

3，脱蜡与复水

脱蜡前，对玻片进行烘烤，56°C 2-3h，其后浸入二甲苯3x5min;然后逐渐用水环境替代切片样本中的二甲苯，复水后的所有步骤，切片都要处在水环境中，防止干片。

4，抗原修复

目的是打开甲醛固定产生的交联，以提高组织抗原的检出率。

热诱导的表位修复(HIER)，HIER对大多数的抗体有益，尤其是对核抗原的修复作用更加明显，最常用的抗原修复缓冲液液是pH6.0，10mM的枸橼酸缓冲液和pH8.0，1mM的EDTA缓冲液，它们的作用原理是通过钠离子的螯合而实现的。最常用的方法有高压加热、微波加热和水域加热，一般是高压锅加热=微波炉加热>水浴锅加热。

蛋白酶诱导的表位修复(PIER):胰蛋白酶(Trpsin)，一般使用浓度为0.1%;胃蛋白酶(Pepsin)，主要用于细胞间质或基底膜抗原的修复。一般浓度为0.4%。

5，淬灭

(1)灭活内源性过氧化物酶：基于HRP检测系统，常用的去除内源性过氧化物酶的方法是3%过氧化氢水溶液，时间不宜过长，最好室温10min。

(2)去除内源性生物素：基于生物素检测系统，在采用生物素方法染色前也可以将组织切片进行0.01%卵白素溶液室温处理20min，使其结合位点饱和，以消除内源性生物素的活性。

(3)灭活碱性磷酸酶(AP)：最常用的方法是将左旋咪挫(以每毫升加24mg)加入底物液中并保持pH值为7.6-8.2，能除去大部分内源性碱性磷酸酶。

6，封闭

利用含5%山羊血清的TBST进行封闭，室温1h，对于磷酸化特异性抗体而言，不要使用含有酪蛋白的试剂进行封闭。

7，一抗孵育

一般按照一抗说明书上推荐的稀释液及比例进行稀释，4°C孵育过夜 。

8，清洗

TBST清洗3次，每次5min。

9，二抗孵育

ABC法：利用连接在二抗上生物素募集大量偶联亲和素的酶进行信号放大

LSAB法：用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶进行信号放大

10，检测

该表格列举了常用的酶和搭配的底物及封片介质，根据实验需要进行选择。

11，检测-复染

常用的染料：苏木精，靶标为细胞核，蓝色或紫色;

核固红：靶标为细胞核，红色

12，清洗、脱水、封片、观察

清洗：TBST清洗3次，每次5min

根据显色的底物选择封固剂(例如，DAB采用非水性的封固剂，所以要先脱水，再用中性树脂封片)