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前期样品处理的过程包括载玻片的制备，脱蜡/复水，抗原修复（上期内容），然后我们需要做样品的封闭，孵育一抗和二抗，以及底物检测，最后的处理步骤包括脱水，封片和观察。PART1我们介绍了样品制备环节，今天我们继续看下PART2抗体孵育及检测。
PART2 抗体孵育及检测
（1）淬灭：如果使用基于酶或者生物素的检测系统，样本中内源性酶的活性（过氧化物酶/碱性磷酸酶）或者内源性生物素会对检测产生非特异性干扰，因此在血清封闭之前需要先对样品进行淬灭。根据使用的二抗偶联标记不同，使用对应的内源性封闭液进行淬灭。
小技巧：使用免疫组化笔在样本周围画圈建立疏水隔离区，可以避免样品间的交叉染色和节约血清和抗体的用量。
操作步骤：将组织切片画上阻水圈，每切片加100μL（用量以浸没样本区域为准，可灵活调节） 3% H2O2，室温下孵育10min，PBST浸洗3min×3次。
（2）封闭：使用血清对样品中非特异性结合位点进行封闭。一般建议在TBST/PBST中加入5%的山羊血清作为封闭液。
需要注意如果使用酪蛋白封闭液（例如牛奶），可能会影响磷酸化抗体的识别。
操作步骤：每张切片加100μL（用量以浸没样本区域为准，可灵活调节）5%山羊血清封闭液，室温孵育30min。
（3）孵育一抗：抗体孵育可以选择直标一抗的方式或者无标记的一抗再偶联HRP标记的二抗。间接检测的方式可以进行信号放大，灵敏度更高，是更为常规的检测方式。一抗用于与样品中的靶标抗原进行特异性结合。
在选择IHC一抗的时候应注意以下几点：
1、一抗的反应种属：一抗的反应种属应与样品的种属一致，并且一抗的宿主来源不同于样品种属。例如：如果样品是小鼠的肿瘤，应选择针对于小鼠的抗体；
2、一抗的特异性：抗体的特异性不好，容易引起非特异性染色，单克隆抗体的特异性优于多克隆抗体。标记mAb的一般是指单克隆抗体；
3、查看抗体说明：查看抗体说明书上面的应用，注意有些抗体仅适用于IHC-P而不适用于IHC-F，根据样本类型进行选择；例如下面这个抗体可以适用于IHC-P。
操作步骤：在样品处加入稀释后的目的蛋白抗体，置入4℃冰箱内过夜，PBST浸洗3min×3次。
（4）孵育二抗：二抗与一抗结合，并带有偶联标记。
在选择IHC二抗的时候应注意以下几点：
b. 多标IHC/IF实验中，建议优先选择经过预吸附处理的二抗，可以避免不同物种间抗体的交叉反应；
c. 某些细胞和组织（巨噬细胞、B细胞、自然杀伤细胞，淋巴结组织，脾脏组织等）表面内源性的Fc端受体过多，建议使用F(ab')₂形式的二抗以避免其与样品Fc受体非特异性结合。
操作步骤：在样品上添加对应的二抗，室温孵育1h，PBST浸洗3min×3次。
（5）底物检测：IHC通过酶和底物反应在抗体结合处显色以检测抗原表达。显色检测中需要根据抗体上的偶联标记来选择对应的底物，常见的偶联标记有HRP和AP。二抗上带有HRP标记时，一般选择DAB作为底物进行检测。
操作步骤：配制即用型DAB工作液，滴加新鲜配制的DAB工作液到切片上，wan全覆盖标本。通常显色1-10min，DAB显色时间需要镜下控制，选择最佳显色时间，做好防护。自来水冲洗终止DAB显色反应。
（6）苏木素复染：苏木素经氧化后生成苏木精，是一种碱性染料，组织学中用于细胞核的染色，染色后的细胞核呈鲜明的蓝色或蓝紫色，可以更方便的查看细胞形态。
操作步骤：滴加适量苏木素以覆盖整个组织，复染 30sec~3min。用自来水wan全冲洗掉复染液。酸酒精（在100ml 70%乙醇中加入1ml盐酸）分化3-5sec后水洗30sec，终止反应。去离子水冲洗切片 3~5min，使胞核返蓝。
明星产品：免疫组化二抗试剂盒（abs957）
二抗检测试剂盒用于IHC实验，包含经过条件摸索和实验验证的最佳搭配试剂和实验方案，试剂盒中包含淬灭剂，封闭液，一抗放大剂，酶标二抗聚合物和显色底物。由于IHC实验一般信号较弱，需要信号放大，建议使用二抗检测试剂盒。
1、减少一抗用量，一抗可再稀释2-4倍；
2、Polymer酶标二抗检测系统，更低背景；
4、单品文献100+，认可度高。
货号
名称
规格
组分
abs957
即用型高效免疫组化二抗试剂盒（鼠兔通用型）
5mL（50张片子）
包含内源性过氧化物酶、非特异性封闭液；一抗放大剂；酶标抗小鼠&兔二抗聚合物和DAB显色液
PART 3 封片和观察
（1）脱水：80%、95%、100%、100%酒精，每步5min、二甲苯5min、重复两次。
（2）中性树脂封片：在玻片上滴加一滴中性树脂，从侧边缓缓盖上盖玻片，动作应尽量缓慢，以防止产生气泡。
IHC常见问题
【高背景】
1、封闭问题
封闭不好是最常见的导致高背景的原因，切记要注意以下几个方面：首先封闭液的浓度我们可以适当增加，并延长封闭时间，来达到更好的封闭效果；其次容易忽略的是我们通常采用稀释的动物血清作为封闭液，这时就要注意血清的种属，最好使用与二抗同种属来源，切记不可使用与一抗同种属来源。
2、抗体浓度
有时一抗的浓度太高会导致较高的背景，因此我们可以在原有一抗浓度的基础上提高稀释度，并减少抗体孵育的时间，来达到降低背景的目的。当然这也和抗体的效价有关，记得认真查看抗体厂家的建议稀释比。
3、内源性物质影响
常见的为内源过氧化物酶和内源生物素，记得要使用H2O2和Avidin来进行封闭处理（abs9333和abs9335）。
【信号弱】
1、抗体影响
厂家在生产抗体的时候会做抗体应用检测，记得查看自己的抗体是否能运用于IHC；其次，抗体的效价较弱，这是我们可以通过提高抗体浓度来增强结果的信号；最后，大家切记在保存荧光二抗的时候要避光。
2、样本保存
应选择新鲜组织进行实验，样品取出后应尽快放入固定液中。固定液现用现配。
3、样本个体差异从Uniprot或者Atlas网站上查看蛋白的定位，修饰等信息，并查询蛋白在不同种属和组织间的表达情况。或者可以先使用其他方法（如WB，Flow等）对样品先进行筛选或设立阳性对照。
【样本形态不好】
1、掉片问题
如果出现样本切片掉片问题，记得使用多聚赖氨酸（abs9170）处理过的玻片，可以有效防脱。另外石蜡切片要注意烤片的温度和时间，以60℃，2-4个小时为最佳。
2、固定问题
固定时一定要保证固定的时间和固定液（abs9179）的体积，固定时间至少在8小时以上，同时固定液的体积至少要是组织块的20倍左右。
3、抗原修复问题
抗原修复不要使用太过剧烈的条件，尤其是对于一些硬质组织样本，本身比较容易脱片。可以适当摸索下修复时间。
常用热卖货号
分类
货号
产品名称
规格
内源性封闭液
abs9333
过氧化物酶封闭液
100mL
abs9334
碱性磷酸酶封闭液
100mL
abs9335
内源性生物素封闭液
100mL
封闭血清
abs933
山羊血清
50mL
abs935
驴血清
50mL
免疫组化笔
abs929
免疫组化笔
1支
abs9785
免疫组化笔plus
1支
显色底物
abs9210
DAB 显色试剂盒（棕黄色，IHC）
1kit
二抗试剂盒
abs957
即用型高效免疫组化二抗试剂盒（鼠兔通用型）
5mL（50张片子）
abs996
即用型免疫组化二抗试剂盒（鼠兔通用型）
5mL（50张片子）
abs997
即用型免疫组化二抗试剂盒（抗小鼠）
5mL（50张片子）
abs998
即用型免疫组化二抗试剂盒（抗兔）
5mL（50张片子）
复染
abs9214
苏木素
100ml
封片
abs9177
中性树胶
100mL
Absin产品线：
爆款产品：试剂盒(mIHC、IHC、凋亡、ELISA、ChIP、Co-IP、TR-FRET、生化检测、残留检测、多因子检测)；细胞培养(类器官试剂盒+基质胶，胎牛血清+培养添加剂+细胞因子)、分化试剂盒；分子(mRNA合成服务+提取试剂盒)；化合物大包装；辅助试剂、耗材/仪器、定制服务(抗体/多肽/蛋白/标记/检测)...
特色产品：鸡胚提取物CEE、B27、N2、霍乱毒素B亚单位CTB、牛脑垂体提取物BPE、百日咳毒素PTX、重组人胰岛素Insulin、人源低密度脂蛋白LDL...