裸鼠（BALB/c）12只，由南方医科大学南方医院实验动物中心提供和饲养，雌雄不限，鼠龄4周，体质量20~25 g，饲养环境：无特定病原体SPF级。鼠笼、垫料、饮用水和食料均经灭菌处理，按标准方式给予。
RPMI Medium 1640培养基（Gibco，美国）、0.25%胰蛋白酶和0.05%乙二胺四乙酸（EDTA）（Gibco，美国）、胎牛血清（FBS）（Gibco，美国）、PBS缓冲溶液（Gibco，美国）、CO2恒温孵育箱（美国Thermo公司）、倒置相差显微镜（Leica M icrosystem s CM S GmbH）、台式离心机（TD5A-WS）、流式细胞仪（Attune NxT，北京鑫磊众森生物科技有限公司）、立体定向仪（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）、Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（凯基生物有限公司）、鼠抗人波形蛋白（vimentin）单抗、鼠抗人上皮膜抗原（EMA）单抗、细胞增殖核抗原（Ki-67）单抗（北京中杉金桥技术有限公司）。
取手术中切除的新鲜脑膜瘤组织标本，放入含双抗磷酸盐缓冲液（PBS）中反复冲洗，眼科剪剪去硬脑膜、烧焦组织、血凝块、蛛网膜等，用眼科剪在无菌条件下剪成1 mm3；37 ℃孵箱内用0.25%胰蛋白酶消化10 min，70 µm滤网过滤，滤液以1000 r/min离心3 min，去上清；加入3 mL红细胞裂解液，吹打混匀3 min后，加入6 mL PBS稀释，离心后去上清，用含10%血清的1640培养基（含青霉素105 U/L、链霉素100 mg/L）混悬细胞沉淀，种植于25 cm2培养瓶中，置于37 ℃、5% CO2细胞孵箱中培养，首次隔天换液，以后每2~3 d细胞密度大于90%进行传代培养；细胞胰酶消化传代后采用差速贴壁法进行纯化肿瘤细胞。
取第3代原代细胞胰酶消化传代后调整细胞密度为5×103，种植于96孔板，对应天数复孔5个。每隔24 h采用CCK-8法检测对应天数的吸光度（A），去除最大、最小值，取剩下3个复孔平均值，连续7 d后绘制生长曲线。另取第3代原代细胞用不含EDTA的胰酶消化，磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞2次（2000 r/min离心5 min）收集1×105细胞，加入500 μL的Binding Buffer，悬浮细胞，加5 μL Annexin V-FITC混匀，加5 μL Propidium Iodide混匀，室温、避光、反应15 min。FITC流式细胞仪检测细胞凋亡情况，细胞生物学重复3次。
将脑膜瘤细胞按1×105/mL密度铺到35 mm的共聚焦皿。培养24 h后，PBS漂洗3次，用4%多聚甲醛固定细胞10 min，PBS漂洗5 min×3次，0.2% Triton X-100细胞膜通透处理10 min，PBS漂洗5 min×3次，用含5% BSA室温封闭1 h，添加一抗后4 ℃冰箱孵育过夜。去除一抗，PBS漂洗5 min×3次，避光条件下滴加荧光二抗（1: 1000），室温孵育1 h，PBS漂洗5 min×3次，DAPI避光染色5 min，PBS漂洗5 min×3次。倒置荧光显微镜（OLYMPUS）暗室下拍照检测波形蛋白Vimentin、EMA的表达情况。
取6只裸鼠，腹部皮肤消毒后腹腔注射135 μL 1%戊巴比妥钠，立体定向仪对裸鼠头部进行固定，两耳针对称地固定裸鼠两侧耳稍前方骨性部位。
在裸鼠内眦连线与头部矢状中线交点后5 mm处纵向切开头部皮肤约长0.6 cm，镊子钝性分离切口两侧皮肤、筋膜，充分暴露颅骨。根据头部立体定向解剖图谱确定钻孔的位置：冠状缝与矢状缝交点后方0.5 mm、中线右方2.5 mm处。用电钻在此定位处钻一孔径约为1 mm小孔。
取第3代对数生长期细胞，消化离心去上清后，用10 μL微量注射器吸取细胞悬液，调整立体定向仪X、Y、Z轴，使注射器头定位于小孔，调节Z轴，垂直缓慢进针，进针深度约为1.5 mm，以1 μL/min的速度缓慢推注细胞悬液，注射完后针头停留2 min再缓慢退针。术后在裸鼠耳部打耳钉标记。
取第3代对数生长期细胞，经0.25%胰蛋白酶消化，离心去上清液，用1.0 mL注射器吸取细胞悬液0.1 mL，向裸鼠皮下缓慢注射，形成皮下小皮丘，平均每个点接种5×106细胞，在裸鼠耳部打耳钉标记。
每日定时检查裸鼠生命状态，每周称量原位成瘤组裸鼠的体质量变化，绘制出裸鼠体重变化曲线图；皮下成瘤组每周定时测量裸鼠皮下肿瘤长径和宽径，计算肿瘤的体积（体积=长×宽×1/2），并绘制皮下肿瘤体积变化曲线图。
接种6周后处死全部裸鼠，取出颅内全脑组织和皮下肿瘤组织，用4%多聚甲醛固定、脱水、蜡块包埋后切片，厚度为4 mm，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化。
将裸鼠原位成瘤切片和皮下成瘤切片进行常规脱蜡，梯度乙醇水化，磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗10 min×3次，3% H2O2孵育10 min，磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗10 min×3次，枸橼酸钠缓冲液（PH6.0）微波炉热修复15 min，待自然冷却后，磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗10 min×3次，一抗4 ℃冰箱孵育过夜；去除一抗后，PBS漂洗10 min×3次，滴加二抗，室温下孵育40 min，PBS漂洗10 min×3次，滴加DAB显色剂，蒸馏水终止反应，苏木素复染，中性树脂封片。
全部资料采用SPSS 19.0软件进行统计分析。计量资料以平均值±标准差表示。
总之，我们首次报道了成功利用人恶性脑膜瘤原代细胞构建小鼠颅内成瘤模型。对研究肿瘤微环境对恶性脑膜瘤的发生，发展以及肿瘤对周边组织侵袭提供了可靠的研究模型。