世界人口的持续增长导致肉类、乳制品等高蛋白食品的需求大幅增加，给我国食品蛋白的供应带来了较大挑战。微生物能够利用二氧化碳、甲烷、甲醇等一碳化合物生产高质量的单细胞蛋白，这种新型蛋白可应用于食品工业。建立微生物蛋白绿色生物制造的食品蛋白生产体系，对保障国家食物蛋白供给安全十分重要。此外，微生物转化一碳化合物制备单细胞蛋白的过程还可以减少碳排放、缓解温室效应，实现可持续发展。
北京化工大学 北京软物质科学与工程高精尖创新中心的傅晓莹、乔玮博、史硕博*主要总结微生物单细胞蛋白在食品工业中的应用；论述近年来微生物利用一碳化合物高效生产单细胞蛋白的研究进展；阐述天然一碳利用微生物的代谢网络机制以及改造前景；展望了利用合成生物学改造微生物从一碳底物生产单细胞蛋白的前景，旨在为微生物单细胞蛋白的商业化生产提供思路。
1、微生物单细胞蛋白在食品领域的商业化发展及安全性评价
单细胞蛋白在食品工业中的应用
微生物单细胞蛋白的蛋白质含量高，含有多种维生素和无机盐，是一种理想的食品蛋白质来源。单细胞蛋白具有良好的组织成型性可用于生产“人造肉”等新食品，Marlow Foods公司利用丝状镰刀菌（Fusarium venenatum）制成单细胞蛋白产品Quorn，该产品主要用于生产香肠肉饼、即食汉堡等，目前在全球15 个国家进行商业化生产。单细胞蛋白含有丰富的必需氨基酸、维生素和无机盐，可作为营养强化剂添加至饼干、饮料和奶制品中，提高食品的营养价值。此外，微藻单细胞蛋白含有丰富的不饱和脂肪酸，其中二十二碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）是人体必需的脂肪酸，目前利用微藻生产的不饱和脂肪酸已作为营养保健食品销售。
单细胞蛋白应用于食品的安全性
安全性是单细胞蛋白能否作为食品生产原料首先要考虑的问题。影响单细胞蛋白安全性的因素包括微生物生产原料的安全性、单细胞蛋白的RNA含量、微生物本身是否产生毒素以及潜在的过敏原等。相关研究人员讨论了单细胞蛋白安全性并指出：生产单细胞蛋白菌株不能是病原菌，菌株不产生毒素；生产原料中重金属残留含量不能超过要求；在微生物培养和产品处理中要求无污染、无溶剂残留和热损害；最终产品应无病菌、无活细胞、无溶剂残留；单细胞蛋白产品必须进行动物毒性实和致癌实验，还要进行人体临床试验，测定人体对单细胞蛋白的耐受性和可接受性，才能用于食品生产。
2、天然微生物利用一碳化合物生产单细胞蛋白
甲醇酵母单细胞蛋白
甲醇酵母是一种重要的甲基营养酵母，包括巴斯德毕赤酵母（Komagataella pastoris）、多形汉逊酵母（Ogataea polymorpha）和博伊丁假丝酵母（Candida boidinii）等，这类酵母通过木酮糖单磷酸（XuMP）途径以甲醇为碳源进行生长。在甲醇酵母中，甲醇首先在醇氧化酶的作用下氧化生成甲醛，然后甲醛和5-磷酸木酮糖（Xu5P）反应，生成的3-磷酸甘油醛和磷酸二羟丙酮进入糖酵解途径参与细胞代谢。甲醇酵母细胞利用甲醇生成甲醛的过程在过氧化物酶体中进行，这有利于降低甲醛对细胞的毒性，从而提高细胞生长速度。甲醇是一种清洁能源，价格低廉且来源充足，利用甲醇为碳源是甲醇酵母用于单细胞蛋白生产的优势，甲醇利用效率决定了其蛋白生产过程的经济性。甲醇酵母培养结束后，培养液经离心、脱水干燥即可得到甲醇酵母单细胞蛋白（图1A）。
化能自养微生物单细胞蛋白
乙醇梭菌单细胞蛋白： 乙醇梭菌是一种厌氧的化能自养菌，它通过Wood-Ljungdahl途径利用CO或CO 2 作为碳源，以H 2 作为还原剂，生产燃料乙醇、微生物蛋白等高附加值化学品。乙醇梭菌等化能自养菌的发酵过程与现有工业发酵技术的相容性较好，是构建一碳气体生物转化细胞工厂的理想微生物之一。乙醇梭菌已通过中国工业微生物菌种保藏管理中心鉴定，经微生物药敏试验、菌种毒力试验、抗生素基因及致病基因检测分析证实乙醇梭菌安全无毒，可作为食品工业菌体蛋白的生产菌种。
好氧甲烷氧化菌单细胞蛋白： 好氧甲烷氧化菌在自然界中分布广泛，根据细菌结构和进化发育关系可分为3 种类型，分别属于变形菌门（Proteobacteria）γ亚型、α亚型和疣微菌门（Verrucomicrobia）。变形菌门的好氧甲烷氧化菌首先利用自身的甲烷单加氧酶将甲烷氧化为甲醇，甲醇再经甲醇脱氢酶催化氧化生成甲醛。随后，变形菌门γ亚型的好氧甲烷氧化菌通过核酮糖单磷酸（RuMP）途径将甲醛进一步转化利用，变形菌门α亚型的好氧甲烷氧化菌则将甲醛转化为甲酸后进入丝氨酸循环。疣微菌门的好氧甲烷氧化菌是先将甲烷转化成CO 2 ，再通过Calvin-Benson-Bassham（CBB）循环将CO 2 转化利用。
光能自养微生物单细胞蛋白
微藻单细胞蛋白： 微藻是重要的光合固碳微生物，它通过CBB循环将CO 2 转化为3-磷酸甘油醛进入中心碳代谢。微藻在光合作用的光反应阶段利用叶绿素将H 2 O分解成氧气，并产生ATP和还原力NADPH，在暗反应阶段利用光反应产生的ATP和NADPH将CO 2 同化为有机物用于自身生长。微藻生长速率较快，其蛋白质量分数高达70%，是单细胞蛋白的重要来源。微藻单细胞蛋白含有较多叶绿素、维生素和不饱和脂肪酸（EPA和DHA），且核酸含量较低，具有生产功能性高蛋白食品的潜力。
紫色光合细菌单细胞蛋白： 紫色光合细菌是一种厌氧的光合细菌，它通过细菌叶绿素（BChls）吸收近红外光，再利用自身丰富的类胡萝卜素吸收可见光。紫色光合细菌包括紫色硫细菌和紫色非硫细菌两类，它们通过CBB循环实现CO 2 的利用。紫色光合细菌不仅可以CO 2 为碳源进行光合自养生长，还可分解利用食品工业废水的有机碳、氮、磷进行异养生长，收集的紫色光合细菌生物质可用于生产单细胞蛋白。
不同种类微生物利用一碳底物合成单细胞蛋白的特性如表1所示。
3、天然一碳利用微生物的代谢网络
RuMP和XuMP途径
RuMP途径存在于甲基营养细菌中，例如甲醇芽孢杆菌和甲基营养型嗜甲基菌；而XuMP途径主要存在于甲基营养酵母中，包括毕赤酵母（Pichia pastoris）、多形汉逊酵母（Hansenula polymorpha）和博伊丁假丝酵母（Candida boidinii）。RuMP、XuMP途径十分相似，都是甲醛结合戊糖进行碳原子重排，一碳分子后续经由糖酵解途径进入中心碳代谢，而戊糖的再生保证循环的持续运转，这两个途径的主要区别在于甲醛进入磷酸戊糖途径的方式。在RuMP途径中，甲醛在己糖磷酸合成酶（HPS）催化下可以与5-磷酸核酮糖（Ru5P）结合生成6-磷酸己酮糖（H6P），然后在磷酸己糖异构酶（PHI）的作用下发生异构化，生成6-磷酸果糖（F6P）进入中心碳代谢（图2A）。在XuMP途径中，在二羟丙酮合成酶（DAS）的作用下，Xu5P的糖醛基团转移到甲醛上，生成3-磷酸甘油醛和二羟丙酮，二羟丙酮可利用二羟丙酮激酶（DHAK）进一步转化为磷酸二羟丙酮（DHAP），从而进入中心代谢（图2B）。
CBB循环
CBB循环的关键酶是RuBisCO，它催化CO 2 亲电加成到烯二醇形式的1,5-二磷酸核酮糖（RuBP），产生不稳定的C 6 中间体。C 6 中间体之后自发水解成两个3-磷酸甘油酸分子，在ATP水解驱动下再由NADPH进一步还原为3-磷酸甘油醛（图2C）。CBB循环生成1 个3-磷酸甘油醛分子需要消耗9 个ATP分子和6 个NADPH分子，能量利用效率较低，其关键酶RuBisCO的催化效率低且对底物CO 2 专一性差。优化其关键酶可以提高CO 2 利用效率，如Durão等通过过表达辅助RuBisCO折叠的GroEL/ES伴侣蛋白基因和敲除用于RuBisCO组装的RbcX伴侣蛋白基因，将RuBisCO的CO 2 羧化效率提高了大约3 倍。
丝氨酸循环
如图3A所示，甲酸通过多步催化反应首先生成活性中间体——5,10-亚甲基-四氢叶酸，在丝氨酸羟甲基转移酶（SHMT）的作用下，5,10-亚甲基-四氢叶酸将其一碳单元转移至甘氨酸从而生成丝氨酸，并经后续多步催化被依次转化为丙酮酸、草酰乙酸、苹果酸等重要中间体，苹果酸则与辅酶A反应生成苹果酰辅酶A，再进一步生成乙醛酸和乙酰辅酶A，乙酰辅酶A作为重要的中心代谢产物可进入后续代谢途径中。丝氨酸循环生成1 分子乙酰辅酶A理论上需要消耗2 分子ATP和3 分子NADPH，还原力和ATP消耗较少。
Wood-Ljungdahl途径
Wood-Ljungdahl途径（也称还原性乙酰辅酶A途径）可将CO 2 和甲酸转化为乙酰辅酶A进入中心碳代谢，该途径需要金属离子和铁氧还蛋白的参与。还原性乙酰辅酶A途径的关键酶包括一氧化碳脱氢酶、甲酸脱氢酶和亚甲基呋喃脱氢酶，这些关键酶对氧敏感，该通路主要存在于化能自养厌氧微生物中，包括产乙酸菌（如杨氏梭菌（Clostridium ljungdahlii））和产甲烷菌，其中产乙酸菌通过H 2 或NADPH提供还原力，而产甲烷菌利用金属还原剂提供还原力。Wood-Ljungdahl途径固定1 分子CO 2 仅需要消耗1 分子ATP和2 分子NADPH，是一种能源利用效率高、生物质产量高的一碳利用途径（图3B）。调控该途径关键酶的表达可显著提高微生物合成单细胞蛋白的效率。Straub等在伍氏醋酸杆菌（Acetobacterium woodii）中选择性过表达了Wood-Ljungdahl途径中4 个关键酶的基因和与ATP生成相关的两个基因，提高了伍氏醋酸杆菌的生长速率。
围绕乙酰辅酶A到琥珀酰辅酶A的一碳利用途径
围绕乙酰辅酶A到琥珀酰辅酶A的一碳利用途径如图4所示。
结论
目前利用一碳化合物实现大规模生产单细胞蛋白的微生物种类主要包括细菌和微藻。这两类微生物单细胞蛋白的蛋白质含量较高，但微藻细胞壁较厚，需要经过细胞破碎来提高单细胞蛋白的可消化性；而细菌蛋白的核酸（尤其是RNA）含量较高，需要增加核酸脱除工艺。与动物和植物蛋白生产相比，目前微生物利用一碳底物生产单细胞蛋白供人类食用成本较高，且相关培养工艺和生产技术仍不成熟。一些微生物单细胞蛋白如乙醇梭菌蛋白已用作饲料蛋白生产，可通过升级生产工艺提高单细胞蛋白的安全性和可接受度，进而用于生产食品蛋白。此外，虽然微生物单细胞蛋白可用于生产高营养食品原料、可直接改善终产品的功能属性，但目前受众面较窄。未来在保持其营养价值的前提下，既要确保单细胞蛋白的安全性和功能性，更要注重产品的颜色、气味、口味等感官特性为食用者所喜欢，从而提高产品在消费者中的可接受度，实现微生物单细胞蛋白食品的产业化发展。
专家简介
史硕博 教授，硕士生导师，北京化工大学软物质科学与工程高精尖创新中心青年PI、教授。2009年于天津大学获得博士学位，随后在瑞典查尔莫斯理工大学和新加坡科技局从事合成生物学研究。2017年加入北京化工大学，主要从事代谢工程与合成生物学的基础与应用性研究，构建和改造微生物使其能够直接用于高效生产化学品、植物天然产物等生物制品。目前担任《合成生物学》、BMC Biotechnology、Frontiers in Bioengineering and Biotechnology、Synthetic Biology and Engineering以及BioDesign Research等学术期刊编委。应邀参加科技部国家重点研发计划评审、领军人才评审；应邀参加国家自然科学基金面上（青年）项目以及中国农业科学院青年创新专项函评；担任北京化工大学分子诊断技术创新研究中心学术委员会委员。个人入选中国医药城第十三批“113人才计划”，发表的论文入选《生物工程学报》以及《合成生物学》年度优秀论文，同时入选“科技期刊双语传播工程”。近年来主持包括国家自然科学基金面上项目在内的国家级基金共10余项，相关成果发表在Metabolic Engineering、Nature Communications和Trends in Biotechnology等本领域高水平期刊，发表论文50余篇，被引1 800余次。
本文《微生物利用一碳底物生产单细胞蛋白研究进展》来源于《食品科学》2023年44卷3期1-11页，作者：傅晓莹，乔玮博，史硕博。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220827-327。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
为构建多元化食物供给体系并兼顾生态环境保护，并形成以生物多样性保护促进食品生产的可持续性，北京食品科学研究院和中国食品杂志社将与北方民族大学、皖西学院、宿州学院、滁州学院于 2023年5月13-14日在中国宁夏银川 共同举办“ 生态保护与食品可持续发展国际研讨会 ”。本届研讨会将围绕新资源食品挖掘、动植物、微生物可替代蛋白、食用菌等食物资源的开发现状、重要创新进展及存在的问题开展研讨，探讨未来食品发展方向，通过展示我国生态保护与食品可持续发展等领域的最新科研成果，搭建科研单位与企业产学研结合的平台，共同促进我国食品产业发展快速踏入新里程。
Food Science of Animal Products（ISSN: 2958-4124, e-ISSN : 2958-3780）是一本国际同行评议、开放获取的期刊，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心主办，中国食品杂志社《食品科学》编辑团队运营，属于食品科学与技术学科，旨在报道动物源食品领域最新研究成果，涉及肉、水产、乳、蛋、动物内脏、食用昆虫等原料，研究内容包括食物原料品质、加工特性，营养成分、活性物质与人类健康的关系，产品风味及感官特性，加工或烹饪中有害物质的控制，产品保鲜、贮藏与包装，微生物及发酵，非法药物残留及食品安全检测，真实性鉴别，细胞培育肉，法规标准等。
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