摘要：诊断为炎症性肠病(IBD)的患者表现出显著的精神疾病患病率，如焦虑和抑郁。然而，与IBD相关的精神疾病的病因仍然不确定，有效的治疗方法尚未建立。在此，本文提出了一种口服水凝胶策略(SP@Rhgel)，通过调节微生物-肠-脑轴，共同递送螺旋藻和大黄酸来治疗IBD和IBD相关的焦虑和抑郁。SP@Rh-gel改善了药物的溶解度、释放特性和肠道保留能力，使口服治疗效果显著提高。口服SP@Rh-gel可抑制NF-κB-caspase-1信号通路，减少肠道炎症，重新平衡被破坏的肠道微生物群落，维持肠道内稳态。此外，SP@Rh-gel维持肠道屏障的完整性，减少促炎细胞因子和脂多糖的释放及其通过血脑屏障进入海马，从而抑制神经炎症，维持神经可塑性。SP@Rh-gel在慢性结肠炎小鼠模型中显著缓解结肠炎症状，以及焦虑和抑郁样行为。本研究证明了微生物-肠-脑轴在IBD合并精神疾病发展中的重要作用，并提出了一种安全、简单、高效的治疗IBD和共病精神疾病的方法。
背景：
炎症性肠病 (IBD) ，包括克罗恩病和溃疡性结肠炎，以胃肠道持续和进展性炎症为特征，导致重大的全球疾病负担。随着对 IBD 认识的加深，人们越来越认识到它不仅仅是一种肠道疾病，它的肠外症状和并发症也越来越受到关注。与一般人群相比， IBD 患者对焦虑、抑郁和其他精神疾病的易感性更高。根据最近的一项荟萃分析， IBD 患者中抑郁或抑郁症状的估计患病率约为 25% ，明显高于一般人群中观察到的估计患病率 3.4% 。此外，焦虑的发生率在这一患者群体中也较高。共病性焦虑或抑郁的存在给IBD的临床管理带来了挑战，潜在地增加了 IBD 的风险和频率，从而降低了 IBD 患者的生活质量。然而， IBD 和精神合并症之间关联的确切机制仍然知之甚少，目前缺乏有效的治疗干预措施。最近的研究探索了抗抑郁药或 IBD 特异性药物对 IBD 合并精神疾病的潜在影响，但研究结果尚无定论。考虑到焦虑和抑郁在 IBD 患者中的普遍存在，这严重影响了他们的生活质量和社会功能，研究 IBD 和精神合并症的病因并开发新的治疗干预途径是必要的。
微生物 - 肠 - 脑轴已被证明在胃肠道疾病和精神疾病之间起着关键作用。肠道菌群和微生物代谢物的失衡导致肠上皮的慢性炎症，并通过微生物 - 肠 - 脑轴加剧神经炎症。与微生物群失调相关的胃肠道炎症可能导致肠道屏障完整性的破坏和肠道通透性的升高。促炎微生物产物，如脂多糖 (LPS) 和细胞因子，穿过受损的肠道屏障，进入血流，从而诱导全身性炎症。因此，体循环中的这些促炎物质可能会破坏血脑屏障 (BBB) ，并渗入关键的大脑区域，如海马体。这种浸润可能导致神经炎症和神经元损伤，从而导致精神疾病的发展。
大黄酸(Rh)是一种亲脂性蒽醌化合物，来源于各种传统的中国草药，包括大黄、芦荟和番泻草。广泛的研究表明，大黄酸具有多种有益的特性，如抗炎、抗氧化、抗肿瘤和神经保护作用。研究发现，大黄酸通过调节肠道微生物群、恢复肠上皮屏障的完整性和调节巨噬细胞极化，在治疗溃疡性结肠炎方面具有抗炎作用。核因子 kappa B (NF-κB) 是参与大黄酸体外抗炎作用的信号分子。此外，已发现大黄酸调节 Toll 样受体 4 (TLR4) 连接的 NF-κB 信号通路具有抗神经炎症特性。神经炎症与精神疾病的发展密切相关，如焦虑和抑郁，其特征是中枢神经系统中促炎细胞因子水平升高，星形胶质细胞和小胶质细胞异常激活。因此，抑制神经炎症被认为是预防焦虑和抑郁发生的可行方法。由于其抗炎、神经保护和微生物调节作用，大黄酸有望成为治疗 IBD 和 IBD 相关精神疾病的前瞻性治疗剂。然而，大黄酸的药物稳定性差、水溶性低、靶向能力有限，严重阻碍了其临床应用。更重要的是，由于胃的降解、肠潴留差、粘膜通透性低等严格的生理障碍，大黄酸的口服给药遇到了很大的障碍，从而阻碍了预期治疗效果的实现。
在这里，本文还重点介绍了螺旋藻(S. platensis)，这是一种富含蛋白质、多糖、矿物质和多种维生素的天然微藻，已被 FDA 批准为功能食品。 [14] 经研究发现，口服 S. platensis (SP) 可有效维持肠道菌群平衡，增强免疫调节，抑制炎症反应。 SP 具有独特的三维螺旋结构和较强的运动能力，有助于改善其生物分布。此外， SP 中丰富的具有荧光特性的光合色素可以无创地跟踪其在体内的分布。因此，由于其有趣的特性， SP 引起了广泛的关注。近年来，本文开发了几种基于 SP 的药物递送策略，用于有效口服治疗肠道疾病，包括溃疡性结肠炎、放射性结肠炎和结肠癌。本文的研究结果表明， SP在通过胃的过程中具有保持其结构完整性的能力，随后被困在肠绒毛中，实现理想的肠道分布和高的口服生物利用度。此外，口服 SP 还可以增加肠道有益菌的丰度，维持肠道微生物群的稳态。基于 SP 的口服策略具有较高的口服安全性、营养价值和较低的培养成本，为治疗 IBD 合并精神障碍提供了一种安全、高效和具有成本效益的解决方案。
在这项研究中，本文开发了一种基于自组装 SP 和大黄酸水凝胶 (SP@Rh-gel) 的口服治疗策略，用于治疗 IBD 和 IBD 相关的焦虑和抑郁 ( 方案 1) 。 SP@Rh-gel 水凝胶改善了SP和大黄酸的药物溶解度、释放动力学和肠道滞留时间，从而提高了口服治疗的疗效。此外， SP@Rh-gel 可通过抑制NF-κB-caspase-1通路减轻 IBD 的肠道炎症，同时保持肠道屏障的完整性，最大限度地减少LPS 和促炎细胞因子对血脑屏障的肠漏。 SP@Rh-gel 可以通过进一步抑制中枢小胶质细胞的激活、减少神经炎症和促进神经发生来缓解与 IBD 相关的焦虑和抑郁样行为。值得注意的是， SP@Rh-gel 口服治疗可以通过调节肠道微生物群落的丰度和多样性来修复 IBD 肠道菌群失衡，增强抗炎和神经保护相关代谢功能，从而维持肠道微生物和代谢稳态。这项工作提出了一种针对IBD或IBD患者心理合并症的微生物-肠-脑轴调节治疗策略。
方案1组装微藻/草药成分水凝胶治疗IBD和IBD相关焦虑和抑郁。Rhein分子通过非共价相互作用自组装形成纳米纤维，并进一步负载SP形成具有三维网络结构的生物活性水凝胶(SP@Rh-gel)。SP@Rh-gel在微生物-肠-脑轴上的调节对IBD和IBD相关焦虑和抑郁的治疗。
结果
采用直接自组装法合成大黄酸水凝胶 (Rh-gel) ，然后加入 S. platensis (SP) ，得到具有三维 (3D) 网络结构的 SP 负载大黄酸水凝胶 (SP@Rhgel)( 图 1a) 。首先，将大黄酸溶解在碳酸氢钠 (NaHCO3) 中，通过超声波简单加热，得到均匀的溶液，冷却至室温形成 Rh 凝胶。本文使用不同浓度的大黄酸 (2 、 3 、 4 、 6 和 8 mg/mL) 合成了大黄酸水凝胶，随后将其命名为 Rh-gel 1 、 Rh-gel 2 、 Rh-gel 3 、 Rh-gel 4 和 Rh-gel 5 。确定大黄酸的凝胶浓度为 4 mg/mL ，只有当大黄酸浓度超过这个阈值时，才会形成水凝胶 ( 图 1b) 。此外，较高浓度的大黄酸会增强稳定性，降低 Rh 凝胶的流动性。然而，当大黄酸浓度为 8 mg/mL 时，观察到透明度下降，表明过量的大黄酸未完全溶解 。
Rh 凝胶样品的紫外 - 可见 (UV-vis) 吸收光谱显示出蒽醌基团的特征峰，其吸光度呈浓度依赖性 ( 图 1c) 。然而，在 Rh-gel 5 中观察到明显的吸光度降低，可能是由于 Rhein 的不完全溶解。荧光光谱显示一个以 592 nm 为中心的发射峰，荧光强度随着大黄酸浓度的增加而减弱，表明大黄酸分子聚集导致荧光猝灭 ( 图 1d) 。与 Rhein 溶液 (Rh-sol) 相比， Rhgel 样品的 zeta 电位在凝胶化后增加，并表现出浓度依赖性 ( 图 1e) 。 X 射线衍射 (XRD) 分析显示，在 d = 3.4 Å 处有一个明显的峰，这是两个分子之间 π-π 堆叠相互作用的典型距离，表明通过 π-π 相互作用进行自组装过程 ( 图 1f) 。对于口服和灌胃给药，后续实验选用流动性和凝胶性合适的 Rh-gel 3 ，简称 Rh-gel 。扫描电镜 (SEM) 图像显示， Rh-gel 由纳米纤维组成，其组织成三维多孔网络结构 ( 图 1g) 。傅里叶变换红外 (FTIR) 光谱显示， O- h 和 C=O 键的特征吸收峰分别从 3437 cm-1 和 1676 cm-1 移动到 1654 cm-1 。这一转变表明氢键在自组装过程中的重要作用。
SP 呈现绿色外观，长度约为 100 μm ，具有标准的螺旋结构，表面微观结构粗糙。此外，在适当的光激发下，由于光合色素丰富， SP 发出红色荧光 ( 图 1h) 。收集 SP 样品，不断搅拌，逐渐加入到 Rh-gel 中，使其均匀混合，得到 SP@Rh-gel 。 Rhein 溶液 (Rh-sol) 最初呈黄色，凝胶化后变为红色， SP 加载后进一步变为棕色 ( 图 1i) 。 SP@Rh-gel 的伪彩色 SEM 图像清楚地表明，在 Rh - 凝胶 ( 红色 ) 的网络结构中存在 SP( 绿色 )( 图 1j) 。 SP@Rh-gel 的紫外可见光谱显示 SP (~680 nm ，绿箭头 ) 和 Rh-gel (~293 nm 和 ~437 nm ，红箭头 ) 的特征吸光度峰 ( 图 1k) 。加载带负电荷的 SP 后， SP@Rh-gel 的 zeta 电位与 Rh-gel 相比有所下降 ( 图 11) 。此外， SP@Rh-gel 在 552 nm 和 450 nm 激发下，分别与 SP 和 Rh-gel 表现出一致的荧光发射峰。 FTIR 光谱显示 SP 在约 3370 cm-1(O-H 和 N-H 拉伸 ) ， 2926 cm-1(C-H 拉伸脂肪族 ) 和 1079 cm-1(C-H 拉伸脂肪族 ) 的显著波段，在 SP@Rh-gel 的相应区域表现出增强的强度。然而， Rh-gel 和 SP@Rh-gel 的 XRD 谱图没有明显的特征峰。与溶液态相比，大黄酸的水凝胶态结构更坚固稳定，附着力更强。此外，即使在加入 SP 后， Rhgel 也保持了其值得称赞的粘附能力。值得注意的是，大黄酸对 SP 活性影响不大，在 SP@Rh-gel 中 SP 仍能保持其完整的形态结构和荧光特性。
研究了 SP@Rh-gel 在不同 pH 值 (1.8 和 7.4) 的 PBS 溶液中模拟胃和肠道环境的药物释放行为。 SP@Rh-gel 在肠道环境中表现出持续的大黄酸释放，在 72 小时内达到约 100% 的释放，而在胃环境中释放最少 ( 图 1m) 。释放介质的相应照片进一步证实了这些发现，在胃环境中呈现无色，在肠环境中呈现亮黄色 ( 图 1n) 。 SP@Rh-gel 的这种药物释放行为使大黄酸在肠道内的释放受到控制，并增强肠道吸收
图一SP@Rh-gel的合成与表征
2.体外抗炎作用
研究 SP@Rh-gel 对大鼠小肠上皮细胞 (IEC-6) 的体外抗炎作用。炎症刺激物 LPS 可诱发炎症介质的产生和氧化应激，包括活性氧 (ROS) 。实时逆转录聚合酶链反应 (RTqPCR) 分析显示， LPS 诱导的 IEC-6 细胞中 NF-κB 和促炎细胞因子，包括肿瘤坏死因子 -α (TNF-α) 、白细胞介素 -6 (IL-6) 和白细胞介素 -1β (IL-1β) 的 mRNA 表达显著增加。然而， SP@Rh-gel 有效抑制了 NF-κB 和这些促炎细胞因子的上调，提示 SP@Rh-gel 通过抑制 NF-κB 信号传导发挥抗炎作用。 LPS 刺激导致 IEC-6 细胞产生活性氧，可见绿色荧光的存在。然而，用 Rh-sol 、 Rh-gel 和 SP@Rh-gel 处理后，细胞中的 ROS 水平显著降低 (P < 0.001) 。流式细胞术分析进一步证实，在 Rh-sol 、 Rh-gel 和 SP@Rh-gel 组中， LPS 诱导的 ROS 生成减少，与阳性对照组 (LPS) 相比， ROS 阳性细胞百分比显著降低 (P < 0.001) 。 Rh-sol 组、 Rh-gel 组和 SP@Rh-gel 组中 ros 阳性细胞的阳性率分别为 51.7% 、 37.2% 和 35.4% 。此外， SP 组 ROS 的生成也有一定程度的减少。此外， Rh-gel 和 SP@Rh-gel 的抗炎作用被发现在相同剂量的 Rhein 下比 Rh-sol 更有效。
通过活细胞 / 死细胞染色和 CCK8 法评估 SP@Rh-gel 对 LPS 诱导的细胞活力的影响。单独用 LPS 处理 24 小时后导致大量细胞死亡 ( 用红色荧光表示 ) 。相反， Rh-sol 、 Rh-gel 和 SP@Rh-gel 处理有效地减轻了 LPS 诱导的细胞活力下降，主要是活细胞 ( 绿色荧光表示 ) 。 CCK8 实验的结果进一步表明， Rh-sol 、 Rh-gel 和 SP@Rh-gel 对 LPS 诱导的细胞死亡的影响是浓度依赖性的。与 ROS 染色结果一致， Rh-gel 和 SP@Rh-gel 在相同剂量的 Rhein 下比 Rh-sol 表现出更高的细胞存活率，这表明 Rhein 水凝胶的疗效增强，细胞毒性降低。这些结果表明， Rh - 凝胶改善了大黄的药物溶解度，控制了大黄的药物释放，从而具有优于游离大黄的抗炎作用。
3.荧光成像特性和生物分布
考虑到大黄酸和 SP 的荧光发射特性，本文首先评估了 SP@Rh-gel 在大黄酸通道下的体外荧光成像 (Ex: 460 nm;Em: DsRed) 和 SP 通道 (Ex: 605 nm;Em: Cy5.5) 。 SP@Rh-gel 在两个通道中都显示出强烈的荧光信号，而 Rh-sol 和 SP 仅在各自的通道中显示荧光成像 ( 图 2a) 。这表明 SP@Rh-gel 在不影响大黄酸和 SP 的荧光特性的情况下是有效合成的。由于体内成像系统无法检测大黄酸的荧光，因此选择了生物学研究中常用的荧光试剂荧光素异硫氰酸酯 ( 荧光素异硫氰酸酯，荧光素异硫氰酸酯， FITC) 作为替代品来模拟大黄酸在体内的生物分布。 Balb/c 裸鼠分别灌胃 300 μL SP 、 FITC 标记的 Rh-sol 和 FITC 标记的 SP@Rh-gel ，分别在不同时间间隔使用 SP 通道和 FITC 通道 (Ex: 488 nm, Em: 528-568 nm) 进行成像。与 SP 或 Rh-sol 组相比， SP@Rh-gel 组胃肠道内 SP 或 FITC 的荧光信号强度分别增加 2.4 倍和 3.3 倍 ( 图 2b 、 c) 。值得注意的是， SP@Rh-gel 组的荧光信号比 SP 和 Rh-sol 组的荧光信号寿命更长，即使在给药后 34 小时仍可检测到。
为了更好地显示 SP@Rh-gel 的生物分布，在不同时间点切除小鼠的主要器官 ( 心、肝、脾、肺、肾和胃肠道 ) 进行离体荧光成像。在给药后 0.5 小时， SP@Rh-gel 表现出快速通过胃，在最初的 4 小时内主要分布在回肠，随后逐渐向盲肠和结肠迁移 ( 图 2d) 。与体内成像结果一致， SP@Rh-gel 组小鼠胃肠道荧光信号强度大于 SP 组，持续时间较 SP 组延长。此外，在心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏等主要器官中未观察到可检测到的信号，这表明口服给药后 SP@Rh-gel 中的 SP 在这些器官中没有积累。肠道组织冷冻切片显示， SP@Rh-gel 组比 SP 和 Rh-sol 组显示出更明显的 SP( 叶绿素 ) 和 Rhein (FITC) 荧光信号 ( 图 2e) 。肠道组织的伪彩色扫描电镜图像进一步显示，在 SP@Rh-gel 处理后的小鼠肠绒毛结构 ( 粉红色 ) 内嵌有大量 SP( 绿色 ) 和大黄酸水凝胶 ( 红色 )( 图 2f) 。上述结果提示 SP@Rh-gel 水凝胶制剂可有效增强大黄分子和 SP 在胃肠道内的局部浓度和滞留时间，从而促进肠道药物吸收，增强药物的口服治疗效果。 SP@Rh-gel 给药后，收集小鼠胃肠道不同部位的内容物，用扫描电镜检查 ( 图 2g) 。结果显示， SP 在胃中呈现相对完整的螺旋结构，在回肠中部分破碎，在盲肠中进一步降解成段，最终在结肠中完全分解成小碎片。结合离体荧光成像结果，这些结果提供了额外的证据，证明 SP@Rh-gel 主要在胃肠道代谢，口服给药后表现出良好的生物降解性。
图二SP@Rh-gel的荧光成像特性及生物分布
基于 SP@Rh-gel 的体外抗炎作用，本文建立了慢性 IBD 小鼠模型，研究 IBD 中焦虑和抑郁的发生，以及 SP@Rh-gel 对 IBD 和 IBD 相关精神症状的持久治疗作用。采用硫酸葡聚糖钠 (DSS) 化学诱导 IBD ，诱导溃疡性结肠炎样炎症。为了建立小鼠慢性结肠炎模型，小鼠进行了三个周期的治疗。每个周期包括 1 周的 DSS 治疗和 2 周的恢复期 ( 图 3a) 。在第二和第三个恢复期，小鼠每隔一天灌胃 PBS 、 Rh-sol 、 Rh-gel 和 SP@Rh-gel ，共 14 次。对照组在给药期间接受相同剂量的 PBS ，并在整个期间饮用不添加 DSS 的饮用水。治疗后，对不同组小鼠的焦虑和抑郁样行为进行评估。在开放场地测试 (OFT) 中，不同组的总距离没有明显变化 ( 图 3b, d) 。然而， DSS 组在中央区域花费的时间减少，表明结肠炎对小鼠的运动能力有影响 ( 图 3e) 。相反， Rh-sol 、 Rh-gel 和 SP@Rh-gel 组在中心区域的时间增加，表明运动能力的恢复。在高架加迷宫 (EPM) 测试中， DSS 组在张开的手臂上花费的时间更短，穿越频率也更低，而 Rh-sol 、 Rh-gel 和 SP@Rh-gel 组明显增加了张开的手臂时间和穿越频率 ( 图 3c 、 f 和 g) 。在强迫游泳测试 (FST) 和悬尾测试 (TST) 中， Rh-gel 和 SP@Rh-gel 组与 DSS 组相比，静止时间都明显减少 ( 图 3h;i). 这些结果表明， DSS 诱导的慢性结肠炎确实会导致精神症状，如焦虑和抑郁。值得注意的是， SP@Rh-gel 的管理对慢性结肠炎相关的焦虑和抑郁样行为均表现出有效的缓解作用。本文还通过 LPS 诱导的抑郁样小鼠模型证明了 SP@Rh-gel 在治疗非 IBD 相关精神疾病方面的潜在功效。行为测试结果表明， SP@Rh-gel 在缓解非 IBD 相关精神疾病的焦虑和抑郁样行为方面表现出有限和不足的功效。综上所述，这些发现为微生物 - 肠 - 脑轴在 SP@Rh-gel 治疗 IBD 相关精神疾病中的实质性参与提供了进一步的证据。
图三SP@Rh-gel防止DSS引起的焦虑和抑郁行为改变
5.神经可塑性与海马成体神经发生的调控
根据行为实验结果，本文推测 DSS 诱导的慢性结肠炎可能通过小胶质细胞介导的炎症通路引起神经毒性，从而导致海马炎症和海马神经可塑性受损。为了评估 SP@Rhgel 潜在的抗炎和神经保护作用，本文通过免疫荧光染色、 RT-qPCR 和 Western blot 技术检测了海马神经发生和促炎细胞因子的表达。具体来说，神经元核 (NeuN) 是成熟神经元的标志，可以结合溴脱氧尿苷 (BrdU) 染色来识别新形成的神经元。双皮质素 (DCX) 是一种编码微管结合蛋白的基因，通常被用作未成熟神经元的标记物。 DSS 可显著降低小鼠海马齿状回 (DG) 区 BrdU+/NeuN+ 标记的新生神经元和 DCX+ 标记的未成熟神经元的密度。相反， SP@Rh-gel 治疗显示海马内 BrdU+/NeuN+ 和 DCX+ 细胞显著增加 ( 图 4a-d) 。 Nissl 染色是一种常用的检查神经组织形态和病理的技术，发现 DSS 组海马 DG 和 CA3 区 Nissl 染色的活神经元减少。然而， Rh-gel 或 SP@Rh-gel 治疗成功地逆转了这些减少 ( 图 4e-g) 。此外，在 DSS 组中，在海马 DG 区观察到离子钙结合接头分子 1 (Iba1) 的表达显著增加， Iba1 是一种用于评估小胶质细胞激活的高度敏感的标志物。值得注意的是， SP@Rh-gel 治疗显示 Iba1 表达显著降低，表明可能抑制小胶质细胞激活 ( 图 4h, i) 。
图四SP@Rh-gel对结肠炎小鼠神经可塑性和海马成体神经发生的影响
6.海马体炎症的调节
此外，通过 RT-qPCR 检测 M1 和 M2 小胶质细胞中小胶质细胞标志物 mRNA 的表达，评估 SP@Rh-gel 对海马炎症的影响。结果显示，在 Rh-sol 、 Rh-gel 和 SP@Rh-gel 处理后， TNF-α 、诱导型 NOS (iNOS) 和环氧化酶 -2 (COX-2) 的 mRNA 表达显著降低，这是 M1 小胶质细胞广泛认可的标志物 ( 图 4j) 。此外，本文还评估了 M2 小胶质细胞常用的标志物白介素 -10 (IL-10) 、精氨酸酶 -1 (Arg-1) 和 CD28 的 mRNA 表达。值得注意的是，在所有治疗组中，只有 SP@Rh-gel 处理显示出 Arg-1 和 CD28 mRNA 表达的显著增加 ( 图 4k) 。这些结果表明 SP@Rh-gel 抑制了 M1 型小胶质细胞的形成，促进了 M2 型小胶质细胞的转化。评估促炎和凋亡细胞因子水平，与对照组或 DSS 组相比，不同治疗组的 NF-κB 和 IL-6 mRNA 表达无显著变化 ( 图 4l) 。而 DSS 组海马 Caspase-1 和 Nod 样受体热蛋白结构域相关蛋白 3 (NLRP3) mRNA 表达量在 Rh-gel 或 SP@Rh-gel 处理后明显降低。同样， IL-1β 的 mRNA 表达在 DSS 组中增加，随后在 Rh-sol 、 Rh-gel 或 SP@Rh-gel 处理后降低。 Western blot 分析显示， DSS 组 NLRP3 蛋白表达升高，随后 Rh-gel 和 SP@Rh-gel 治疗组 NLRP3 蛋白表达降低。此外，磷酸化 NF-κBp65 (p-P65) 蛋白水平在 DSS 组升高，随后在 Rh-gel 和 SP@Rh-gel 组降低 ( 图 4m-o) 。
在焦虑和抑郁的病因学中，中枢神经系统炎症可能归因于病原体的升高，如 LPS 、促炎细胞因子和体循环中的细菌。因此，使用酶联免疫吸附试验 (ELISA) 技术评估海马和血浆中的 LPS 水平。 ELISA 结果显示，与对照组相比， DSS 组血浆和海马中的 LPS 水平均显著升高。然而，与 DSS 组相比， SP@Rh-gel 组在血浆和海马中的 LPS 水平均显著降低。相关分析结果显示海马 LPS 水平与血浆 LPS 水平呈正相关，提示 LPS 诱导的 LPS 升高可能是中枢神经炎症的重要因素。此外，研究发现 SP@Rh-gel 治疗可有效抑制 DSS 诱导的小鼠全身炎症。结果显示， DSS 组血浆和海马中促炎细胞因子，包括 TNF-α 、 IL-6 和 IL-1β 的表达水平显著增加。此外， DSS 组血浆中 S100 钙结合蛋白 β 亚基 (S100β) 的水平也显著升高， S100β 是脑损伤和血脑屏障破坏的生物标志物。这些结果表明，给药 DSS 导致全身 LPS 水平和促炎细胞因子水平升高，导致血脑屏障完整性受损并随后渗入大脑，从而诱发海马炎症。然而， SP@Rh-gel 治疗显示出逆转上述变化的显著能力，从而表明其在减轻致病性物质的产生和泄漏以及保持血脑屏障完整性方面具有潜力。值得注意的是，促炎病原体渗漏到血液中引起的全身性炎症可能归因于肠道炎症和肠道屏障完整性和功能受损。
7.抗肠道炎症的抗炎作用
此外，本文研究了 SP@Rh-gel 对 DSS 诱导的慢性结肠炎肠道炎症的潜在抗炎作用 ( 图 5a) 。在整个治疗期间，本文观察到 DSS 组小鼠的平均体重比对照组和 SP@Rh-gel 组都要低，这表明 SP@Rh-gel 治疗可以减轻 DSS 引起的体重下降 ( 图 5b) 。此外， DSS 小鼠表现出严重的结肠炎症状，如直肠出血和腹泻，通过给药 SP@Rh-gel 有效缓解 ( 图 5c) 。第 9 周，如上所述进行行为测试，随后对小鼠实施安乐死并收集结肠组织进行进一步实验。结肠缩短被认为是结肠炎症的间接指标。 DSS 组结肠缩短明显 (6.33±0.53 cm) ，而 Rh-sol(7.02±0.53 cm, P < 0.01) 、 Rh-gel(7.38±0.32 cm, P < 0.01) 和 SP@Rh-gel(8.02±0.42 cm, P < 0.001) 组结肠缩短明显减少 ( 图 5d, e) 。经 SP@Rh-gel 治疗后， DSS 性结肠炎的另一临床表现脾肿大得到缓解 ( 图 5f 、 g) 。
结肠组织病理学检查显示， DSS 引起肠上皮严重损伤和隐窝结构破坏，而 SP@Rh-gel 处理小鼠的上皮屏障结构保持完整 ( 图 5h) 。为了进一步研究 SP@Rh-gel 在结肠炎中的抗炎机制，本文对结肠组织进行了免疫组化检查，并评估了促炎细胞因子的表达水平，包括 TNF-α 、 IL-6 和 IL-1β( 图 5i) 。与 DSS 组相比， SP@Rh-gel 组结肠组织中 TNF-α 、 IL-6 和 IL-1β 蛋白的表达较低，表明结肠炎症减轻。结肠炎严重程度的组织病理学评分 (0-10 分 ) 和促炎细胞因子表达的量化结果一致 ( 图 5j) 。与 DSS 组相比， SP@Rh-gel 组的组织学评分显著降低，表明炎症严重程度、炎症程度和隐窝损伤水平较低 (P < 0.001) 。与 DSS 组相比， SP@Rh-gel 组 TNF-α 、 IL-6 、 IL-1β 的表达水平显著降低 (P < 0.001) 。
图五SP@Rh-gel对肠道炎症的抗炎作用
8.肠上皮屏障功能障碍的保护作用
Claudin-1 、 Occludin-1 和 Zoonula Occluden-1 (ZO-1) 蛋白是肠上皮紧密连接的重要组成部分，对维持上皮屏障的完整性至关重要。采用免疫荧光染色研究这些紧密连接蛋白在结肠组织中的表达 ( 图 6a, b) 。结果显示，与对照组相比， DSS 诱导的结肠炎中 Claudin-1( 绿色 ) 、 Occludin-1( 黄色 ) 和 ZO-1( 红色 ) 的表达水平显著降低，表明肠道屏障功能严重破坏。此外，在 DSS 组的血浆中观察到 Zonulin 的上调， Zonulin 是内皮细胞和上皮细胞紧密连接的关键调节剂，可以增强肠道的通透性。然而， SP@Rh-gel 治疗可以显著恢复紧密连接蛋白的消耗，降低血浆 Zonulin 水平，表明其具有恢复肠屏障完整性的潜力。与免疫组化染色结果一致， RT-qPCR 分析也显示 SP@Rh-gel 处理后结肠组织中 TNF-α 、 IL-6 和 IL-1β mRNA 表达水平显著降低 ( 图 6c) 。这些结果表明， Rh-sol 、 Rh-gel 和 SP@Rh-gel 在抗炎症和肠屏障修复方面表现出不同程度的功效。值得注意的是， Rh-gel 的治疗效果优于 Rh-sol ，这表明大黄水凝胶可以潜在地增强大黄的口服治疗效果。
此外，透射电子显微镜 (TEM) 图像显示 SP@Rh-gel 对小鼠结肠紧密连接和微绒毛具有保护作用 ( 图 6d) 。在 LPS 诱导的 Caco-2 单层细胞模型中进一步评估 SP@Rh-gel 对肠上皮屏障的保护作用 ( 图 6e) 。经上皮电阻 (Teer) 的评估是评估上皮细胞单层屏障完整性的常用方法。用 Rh-sol 、 Rh-gel 和 SP@Rh-gel 给药后， LPS 处理的 Caco-2 细胞单层的 Teer 值升高 ( 图 6f) 。为了进一步研究 SP@Rh-gel 处理对肠上皮屏障通透性的影响，本文进行 FITC- 葡聚糖 4kDa (FD-4) 肠通透性试验。研究结果表明， LPS 诱导的肠通透性升高被 Rh-sol 、 Rh-gel 和 SP@Rh-gel 处理显著抵消 ( 图 6g) 。综上所述，口服 SP@Rh-gel 可有效减轻肠道炎症，增强肠道屏障功能，从而减轻 DSS 诱导的慢性结肠炎的结肠炎症状。
图六SP@Rh-gelDSS诱导的肠上皮屏障功能障碍的保护作用
9.肠道菌群和微生物代谢产物的调控
微生物群已经成为肠道和大脑之间交流的关键参与者，并且已经提出了微生物 - 肠道 - 脑轴。尽管尚处于起步阶段，但微生物群落多样性对人类肠道神经系统和中枢神经系统发育、胃肠功能、情绪、和行为的影响的研究为脑和胃肠疾病的前瞻性治疗干预带来了重大希望。为了研究 DSS 暴露和各种治疗干预后小鼠肠道微生物群的特征，进行了 16S 核糖体 DNA (rDNA) 基因测序。各组间的 α 多样性指数，包括 Chao1 指数、 Shannon 指数和 Simpson 指数均未发生显著变化 ( 图 7a) ，说明小鼠的物种丰富度在各种处理后均未发生显著变化。 β 多样性的主坐标分析 (PCoA) 图显示， DSS 组与对照组和 SP@Rh-gel 组之间的微生物组成存在显著差异 ( 图 7b) 。此外，群落柱状图分析显示了门水平上不同类群微生物群的相对丰度 ( 图 7c) ，而群落热图分析显示了属水平上差异微生物群的相对丰度 ( 图 7d) 。在两个水平上进行的聚类分析表明， SP@Rh-gel 治疗主要通过调节肠道微生物群的组成来调节肠道微生态失调。此外，对属水平微生物群谱的检查表明，所有处理组都成功逆转了 DSS 诱导的 Candidatus_Stoquefichus 和 Monoglobus 相对丰度的增加。
采用线性判别分析效应大小 (LEfSe) 分析确定 SP@Rh-gel 组和 DSS 组之间的微生物组成差异 ( 图 7e) 。口服 SP@Rh-gel 可使小鼠体内 liilactobacillus 、 Faecalibacterium 、 Muribaculum 、 Anaerostipes 和 Phascolarctobacterium 的相对丰度上调。这些特定的细菌群被认为参与了短链脂肪酸 (SCFAs) 的产生，并表现出一定的抗炎特性。值得注意的是， Akkermansia 在 DSS 组的相对丰度明显高于 SP@Rh-gel 组。考虑到 LPS 主要在革兰氏阴性菌中产生，本文使用 BugBase 预测了生物体水平的微生物表型。本文的研究结果显示， SP@Rh-gel 显著降低了慢性结肠炎小鼠体内革兰氏阴性菌的丰度 ( 图 7f) 。总体而言， SP@Rh-gel 通过保持肠道微生物的稳态，在 DSS 诱导的慢性结肠炎中表现出显著的治疗效果。
微生物代谢物被认为是微生物 - 肠 - 脑轴交流的关键途径。因此，本文进一步分析了不同处理后小鼠粪便样品中代谢物的变化。主成分分析 (PCA) 得分图显示， 6 组小鼠肠道微生物代谢产物的空间分布模式不同，提示 DSS 和不同处理对肠道微生物代谢的特异性影响 ( 图 7g) 。随后，利用正交偏最小二乘判别分析 (OPLS-DA) 阐明两组之间代谢物的定量变化，发现 DSS 组与对照组和 SP 组之间存在显著差异 ( 图 7h) 。火山图描绘了比较组之间代谢物的差异 ( 图 7i) 。值得注意的是，与对照组相比， DSS 组在 130 种代谢物水平上表现出显著变化，但这些变化在 SP@Rh-gel 治疗后部分恢复。鉴定的差异代谢物包括吲哚丙烯酸、吲哚 -3- 乙酸、硫胺素和异丁酸。基于差异代谢物的 KEGG 代谢途径富集分析显示，影响最显著的途径是硫胺素代谢、维生素 B6 代谢、牛磺酸和次牛磺酸代谢 ( 图 7j) 。前两种代谢途径通常与炎症有关，而后者与神经保护有关。此外， Spearman 的相关分析研究了 SP@Rh-gel 组中微生物群与微生物代谢物之间的关系。结果表明，硫胺素和吲哚丙烯酸水平与 liilactobacillus 、 Anaerostipes 和 Muribaculum 丰度呈显著正相关，与 Candidatus_Stoquefichus 和 Monoglobus 丰度呈显著负相关。这些发现表明 SP@Rh-gel-treated 结肠炎小鼠的肠道微生物群和肠道微生物代谢物之间存在很强的相关性。
图七16S rDNA扩增子测序及粪便代谢组学分析
10.体外对NF-κB通路激活的抑制作用
NF-κB 通路参与多种生物过程，尤其是炎症反应。 NF-κB 一直被认为是一个典型的促炎信号通路，在促炎细胞因子、趋化因子和粘附分子的表达中发挥着关键作用。接下来，本文通过抑制 NF-κB 信号通路来研究 SP@Rh-gel 的抗炎作用。采用 LPS 诱导的 RAW264.7 巨噬细胞和 LPS 诱导的 BV-2 小胶质细胞激活分别建立体外外周炎症模型和体外神经炎症模型。值得注意的是， Rh-sol 、 Rh-gel 和 SP@Rh-gel 处理在 RAW 264.7 细胞和 BV-2 细胞中均显示出显著的抑制 LPS 诱导的 NF-κB 转运的能力。此外，这些处理还显示出 RAW 264.7 细胞和 BV-2 细胞中促炎细胞因子如 TNF-α 、 IL-6 和 IL-1β 的显著下调。这些发现证明 SP@Rh-gel 能够通过抑制 NF-κB 信号通路的激活来抑制外周和中枢炎症。
11.神经突体外增殖和生长的调控
PC-12 细胞系来源于大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤，广泛应用于神经科学研究，特别是神经毒性、神经保护和神经炎症的检测。 LPS 激活 BV-2 小胶质细胞，通过 NF-κB 信号通路引发炎症反应，可诱导神经元细胞死亡，阻碍神经突生长。因此，采用由 LPS 活化的 BV-2 小胶质细胞和 PC-12 细胞组成的共培养系统作为体外模型，评估 SP@Rh-gel 对神经元增殖和神经突生长的神经保护作用 ( 图 8a) 。在 Rh-sol 、 Rh-gel 和 SP@Rh-gel 处理后，与 LPS 组和 LPS + SP 组相比， PC-12 细胞表现出更长的神经突和更多的分支 ( 图 8b-d) 。
分离小鼠原代神经元细胞和小胶质细胞，共培养免疫荧光染色，进一步评价原代神经元细胞的凋亡和神经突生长情况 ( 图 8e) 。 β - III 微管蛋白抗体 (Tuj1) 被广泛认为是神经元特异性标志物，末端脱氧核苷酸转移酶 (TdT) dUTP 镍端标记 (TUNEL) 是细胞凋亡的一个指标。同样，与 LPS 组相比， LPS + Rh-sol 、 LPS + Rh-gel 和 LPS + SP@Rh-ge 组的神经突生长明显增加，神经元凋亡明显减少。 Tuj1 荧光信号增强， Tunel 阳性细胞数量减少 ( 图 8f,h) 。这些发现表明 SP@Rh-gel 具有促进神经细胞增殖和神经突生长的能力，同时也能防止神经元凋亡，从而作为一种神经保护剂。
图八SP@Rh-gel对体外神经突增殖和生长的影响
12.口服生物安全评价
疗效和生物安全性是治疗药物临床转化的前提条件。首先，评估 SP@Rh-gel 及其组分在 IEC-6 和 BV-2 细胞中的体外生物相容性。在选定的 SP (0-10 μg/mL) 和 Rh-gel (0-20 μg/mL) 浓度范围内，与 SP 、 Rh-gel 和 SP@Rh-gel 共孵育 24 小时后， IEC-6 和 BV-2 细胞的细胞存活率均保持在 80% 以上，说明 SP@Rh-gel 及其各组分均具有良好的体外生物相容性。本文进一步进行了 SP 、 Rh-sol 、 Rhgel 和 SP@Rh-gel 的综合口服生物安全性分析。雄性 C57BL/6J 小鼠每隔一天灌胃 300 μL PBS 、 Rh-sol (4mg /mL) 、 Rh-gel (4mg /mL) 和 SP@Rh-gel (SP = 2mg /mL, Rh = 4mg /mL) ，连续 1 个月。给药后，采集小鼠全血和血清进行血常规和生化分析，同时切除主要脏器 ( 脑、心、肝、脾、肺、肾、胃、肠 ) 进行组织病理学评估。
结果显示，治疗组血常规及生化指标与对照组无明显差异，各项指标均在正常变化范围内。此外，脑组织的组织病理学检查显示，所有组的大脑皮层和海马结构都完好无损。心、肝、脾、肺、肾、胃、肠等组织切片未见明显损伤及病理改变。这些数据表明 SP@Rh-gel 及其组分具有良好的长期口服生物安全性，无血液毒性和组织毒性。
本研究提出了自组装微藻/草药成分水凝胶治疗DSS诱导的IBD小鼠胃肠功能障碍和共病精神症状的疗效和机制的新发现。具体而言，本文采用一步直接自组装的方法成功合成了大黄酸水凝胶，随后将其装载生物活性SP以生成SP@Rh-gel。值得注意的是，本研究的制备方法和原料都是天然、绿色、环保、高性价比的。实验结果表明，SP@Rh-gel可显著提高口服大黄酸和SP的溶解度、药物释放动力学和肠道滞留特性。体外和体内试验均提供了大量证据，支持SP@Rh-gel口服治疗在减轻肠道炎症、修复肠道屏障损伤、调节肠道微生物群和微生物代谢物方面的有效性。此外，它对中枢小胶质细胞的激活和神经炎症有抑制作用，对神经元的存活和活性有保护作用。因此，观察到的效应对微生物-肠-脑轴的调节产生了实质性影响，从而改善了DSS诱导的IBD小鼠模型中与结肠炎、焦虑和抑郁相关的症状。
大黄，在西方国家通常被归类为蔬菜，在中国传统医学中有着重要的意义，因为大黄的根是干的。大黄或其提取物已被证明具有抗菌，抗炎，抗氧化，抗糖尿病和神经保护特性。Rhein是大黄的主要成分，对金黄色葡萄球菌具有抗菌特性，并且已发现可以增强大鼠回肠中的细菌多样性。此外，研究表明，大黄酸阻碍NF-κB通路的激活，抑制促炎细胞因子的产生。此外，大黄酸作为抗炎药物二乙酰环素的活性代谢物，可有效抑制白细胞介素-1 (IL-1)活性。S. platensis是一种商业微藻，具有多种生物活性，被广泛用作食品和健康相关产品的功能性成分。先前的研究表明，口服S. platensis的水提取物有可能降低促炎细胞因子的表达，并调节与DSS诱导的结肠炎相关的炎症反应。此外，本文之前的研究表明，直接口服S. platensis可以增加有益菌的丰度，包括乳酸杆菌科和幽门螺杆菌科，通过产生SCFA导致肠道通透性降低和肠道屏障增强，从而减轻辐射引起的小鼠肠道损伤。
SP@Rh-gel治疗IBD的疗效可能与其抑制NF-κB-caspase-1信号通路和调节肠道菌群的能力有关。此外，本文的研究结果表明，微生物-肠-脑轴在IBD伴焦虑和抑郁的发展中发挥了重要作用。为了模拟IBD中肠道功能障碍和精神症状的进展，本文建立了DSS诱导的慢性结肠炎小鼠模型。在这个模型中，本文评估了SP@Rh-gel对与焦虑和抑郁相关的IBD的影响及其与肠道微生物群的关系。DSS诱导的慢性结肠炎小鼠出现严重的肠道功能障碍和精神障碍，包括焦虑和抑郁样行为。此外，与对照组小鼠相比，DSS处理小鼠的微生物群落结构明显被破坏。值得注意的是，在属水平上，在DSS组观察到Akkermansia的显著升高。尽管这种细菌被认为是一种潜在的益生菌，一些研究提出它与肠道炎症有关。对潜在机制的研究表明，Akkermansia是一种革兰氏阴性菌，具有降解肠道粘液屏障的能力，使肠道容易受到病原体的侵袭，从而导致局部炎症。此外，已经观察到Akkermansia的患病率与nod样受体家族pyrin结构域6 (NLRP6)的表达呈负相关，NLRP6是一种负责保护肠道免受伤害的先天免疫受体。总的来说，这些发现强烈暗示Akkermansia丰度的增加与IBD的发展之间存在联系。本文还发现两种经典益生菌，liilactobacillus和Faecalibacterium在DSS组中下降，这与临床结果一致。[36]SP@Rh-gel治疗可显著调节被破坏的微生物群落，并逆转慢性结肠炎小鼠的这些细菌变化，提示SP@Rh-gel对IBD的保护作用可能与微生物调节密切相关。
微生物代谢分析进一步表明，硫胺素代谢、维生素B6代谢、牛磺酸和次牛磺酸代谢等代谢途径可能是SP@Rh-gel治疗IBD及IBD相关焦虑和抑郁的途径之一。此外，在DSS组中观察到两种众所周知的益生菌liilactobacillus和Faecalibacterium的丰度减少，与临床结果一致。值得注意的是，SP@Rh-gel有效地调节了被破坏的微生物群落，并逆转了DSS诱导的细菌属的变化。此外，微生物代谢分析揭示了代谢途径，如硫胺素代谢、维生素B6代谢、牛磺酸和次牛磺酸代谢，可能参与SP@Rh-gel治疗IBD和相关焦虑和抑郁的治疗效果。然而，目前的研究结果初步确定了参与SP@Rh-gel微生物代谢调节的潜在代谢途径和代谢物。为了提高结果的可靠性和准确性，进一步全面和系统的调查是必要的。
在健康个体中，紧密的肠道屏障阻止了病原微生物的浸润，胃肠道的先天免疫系统有效地控制了炎症反应。然而，长期暴露于DSS可能会引起持续的肠道炎症，导致肠道微生物群的有害改变。这些有害的改变可以通过调节紧密连接蛋白的表达来增强肠道通透性，最终导致微生物渗漏。对结肠样本的TEM分析显示，DSS组肠道屏障的紧密连接受到破坏，微绒毛缺失，而SP@Rh-gel的使用保留了肠道屏障的完整性。此外，免疫荧光染色和RT-qPCR分析表明，DSS引起的肠屏障结构损伤可能与紧密连接蛋白Claudin-1、Occludin-1、ZO-1的缺失有关。相反，SP@Rh-gel治疗通过上调这些紧密连接蛋白的表达来恢复肠屏障功能。此外，ELISA检测血浆LPS水平表明SP@Rh-gel可减轻DSS诱导的肠漏。LPS通过受损的肠道屏障转移到肠道组织后，激活肠道免疫细胞产生更多的促炎细胞因子，如TNF-α、IL-6和IL-1β，从而加重局部肠道炎症。免疫化学染色和RT-qPCR分析显示，DSS诱导的结肠组织中促炎细胞因子显著增加。体外实验进一步证实了DSS诱导的肠道炎症与NF-κB核易位之间的关联。相反，SP@Rh-gel有效抑制NF-κB信号通路，降低促炎细胞因子的表达。综上所述，DSS可通过激活NF-κB信号通路增强肠道通透性，加重肠道炎症，而SP@Rh-gel治疗可改善DSS诱导的肠道功能障碍。
DSS引起的严重肠道炎症导致血流中致病性LPS和促炎细胞因子水平升高，从而引发全身性炎症，损害血脑屏障的完整性，进而破坏中枢神经系统，引起神经炎症。本文的研究结果表明，DSS治疗小鼠血浆LPS水平显著增加。然而，SP@Rh-gel有效地减弱了DSS引起的血浆LPS水平升高。此外，促炎细胞因子的存在促进了LPS和促炎细胞因子从血浆中穿过受损的血脑屏障的浸润，正如海马中LPS水平升高所证明的那样。值得注意的是，海马体是一个重要的大脑区域，与情绪调节和情绪障碍的病理生理学有关。此外，海马体是个体一生中不断发生神经发生的大脑区域之一。海马DG区的神经干细胞(NSC)龛与压力和情绪行为的调节有着复杂的联系。因此，包括焦虑和抑郁在内的精神疾病与海马神经发生密切相关。此外，越来越多的实验和临床发现表明，外周炎症可破坏神经元功能并对神经发生产生不利影响，最终导致长期行为改变。事实上，慢性神经炎症或外周炎症过程也可以破坏海马回路内新神经元的分化、成熟、迁移和功能整合。激活的小胶质细胞作为中枢神经系统的常驻巨噬细胞，可显著加重神经炎症和神经退行性变。本文的研究结果显示，促炎小胶质细胞的激活与海马神经发生的下降有关，导致DSS治疗小鼠出现精神疾病，包括焦虑和抑郁。体内和体外研究均表明SP@Rh-gel可减少LPS进入海马，促进小胶质细胞由M1型向M2型极化，增强神经发生和神经元活性，从而发挥抗神经炎症和神经保护作用。
结论
总之，本文的研究结果表明，口服 SP@Rh-gel 可以调节炎症途径，改变肠道微生物群的多样性、组成和功能，从而通过微生物群 - 肠 - 脑轴改善 DSS 诱导的慢性结肠炎小鼠的结肠炎症状和焦虑和抑郁样行为。 SP@Rh-gel 治疗可通过维持肠屏障完整性、抑制 NF-κB-caspase-1 信号通路、调节小胶质细胞从 M1 到 M2 的极化，减轻外周和中枢炎症反应，促进神经发生。此外， SP@Rh-gel 治疗可以通过调节肠道微生物群的多样性和组成以及与炎症、焦虑和抑郁相关的肠道微生物代谢物来恢复 DSS 引起的肠道微生物群失衡。这些发现强调了微生物 - 肠 - 脑相互作用在 IBD 患者焦虑和抑郁发生中的重要作用，并为 IBD 及其相关精神合并症的治疗提供了一种有希望的治疗方法。
原文链接：Microalgae-Based Hydrogel for Inflammatory Bowel Disease and Its Associated Anxiety and Depression
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