第七篇 只此青绿——Cyanidiales：Cyanidioschyzon、Cyanidium和Galdieria
在读博士的时候，因为有一些文库基因比对的工作，就注意到Cyanidioschyzon、Cyanidium和Galdieria这三个属名，因为工作内容不在这方向，当时大略一扫，只留下如：第一个真核细胞、热泉口等几个关键词的印象。一晃十七八年过去，再看到这几个词，内容的丰富度，已经完全不同了。
先简单说下红藻门的分类情况，红藻（Rhodophyta）是一群古老的光合真核生物，甚至有观点认为它在植物和真菌的共同祖先出现之前就已经分化出来。红藻是一组多种多样的生物，包含多细胞和单细胞物种，可以在广泛的栖息地定居，包括海洋和淡水、热硫泉和火山环境。红藻的分类已经被多次修订和更新，目前有观点认为红藻分为两个亚门： Cyanidiophytina和Rhodophytina，其中亚门Cyanidiophytina只有一个纲一个目，即本篇所涉及的内容。
在基因组测序难度如同种大白菜的今天，分类这个领域，意见相岐的研究人员之间依然能打出狗脑子来，相比大部分门类从混乱到清晰，微藻等少数类群里的一部分内容到今天还是有争议，Cyanidioschyzon、Cyanidium和Galdieria三个属种自命名至今也是变动频繁。
综合了一下近几年的报道，以上三个属，均归于Cyanidiophyceae纲，Cyanidiales目，并分别占据Cyanidiales目下的三个科：Cyanidioschyzonaceae科、Cyanidiaceae科和Galdieriaaceae科，代表种分别为Cyanidioschyzon merolae、Cyanidium caldarium和Galdieria sulphuraria。2020年，台湾学者为这个门类增添了一个新属新种：Cyanidiococcus yangmingshanensis，由此增加到四个属（如下表所列）。
表1. Cyanidiophyceae纲内分类信息
图1. AlgaeBase中Cyanidioschyzon merolae、Cyanidium caldarium和Galdieria sulphuraria三个种的光镜照片
没有中文名还是给国人，至少给我很大的困扰。
前面提到的Cyanidiophytina亚门，有被翻译为紫藻亚门，相应的往下依次可以称为紫藻纲、紫藻目等。但是，就观察到的藻细胞颜色，要跟“紫”联系起来，实在需要很大的想象力。
如果从拉丁文开始分析，Cyanidi-这个词根有青绿/青蓝的意思，与其着“紫”，不如“青绿”，跟藻的外观也更符合。相应的把表里对应的词叫青绿（或青蓝）藻纲Cyanidiophyceae、青绿藻目Cyanidiales、青绿藻科Cyanidiaceae及青绿藻属Cyanidium；Cyanidioschyzonaceae和Cyanidioschyzon可以叫裂殖青绿藻科和裂殖青绿藻属；Galdieria源于人名Galdieria，因此Galdieria sulphuraria可以叫嗜硫加尔迪里藻；而台湾学者新发现的Cyanidiococcus yangmingshanensis可以叫阳明山青绿球藻。
当然以上为非专业人士即本人翻译，如有错误概不负责。
图2. 上图a&b为酸性温泉水池及附近岩石上的青绿藻（日本，Dr. Sumiya）；下图c-e为同比例标尺下三种青绿藻的光镜照片：（c）Cyanidioschyzon merolae 10D、（d）Cyanidium caldarium RK-1和（e）Galdieria sulphuraria 074（Miyagishima et al., 2017）
青绿藻目Cyanidiales，是12亿年前从其他物种中分化出来的最古老的红藻，已知的有发现较早的三个属裂殖青绿藻属Cyanidioschyzon、 青绿藻属Cyanidium和加尔迪里藻属Galdieria，以及新发现的青绿球藻属Cyanidiococcus，目前为止，鉴定有10来个种，鉴于研究内容的丰富度，本稿仅介绍Cyanidioschyzon、Cyanidium和Galdieria三个属及代表种。
（一）形态与生理特征
青绿藻目相比于其他门类，有诸多的特点。首先是这个门类几乎全部生存在一些极端环境中，比如强酸性（pH 0.05-3）的泉水、火山口、矿山、60℃的热泉口，低温洞穴（4-10℃，湿润而无光/弱光）等，这些类型的环境分布在世界各地，如美国黄石国家公园的热硫泉或冰岛、意大利、印度尼西亚、新西兰和日本的火山地区，几乎是这些区域唯一生存的光合作用生物。经常有多个种共同生存在同一个区域，耐酸、耐高温和耐盐的能力让它们不容易被污染而易于培养，而且因为颜色与环境显著的不同，更容易被发现而采样，进而被研究。目前全世界已经记录采集了500多个样品，尤其那不勒斯费德里克二世大学（University of Naples Federico II）收集了400多个“耐热-嗜酸”样品，但是目前只有不到十个种得到深度的研究。
图3. 美国黄石国家公园火山泉的青绿藻（Andreas Meyer）
图4. 雷克雅未克（冰岛）硫磺热泉口岩石上分布的G. sulphuraria（Christine Oesterhelt）
由于在10多亿年前就开始分化，三个属种间的遗传差异非常巨大，如C. merolae和G. sulphuraria之间的遗传差异几乎和果蝇与人类间的差异相等，究其原因，可能为严酷环境导致的DNA高损伤率因而引起的高突变率/演化速率。但是，尽管以散点状分布在世界各地的特定极端环境，相互间不能形成“交流”，青绿藻目内的属种之间生理和形态特征等非常相似，认为是所处的极端环境，导致细胞始终处于高度的选择压力之下，因而导致其形态和生理的多样性最小化。当然Cyanidioschyzon、Cyanidium和Galdieria这三个属种还是可以通过细胞形态学和生理生态特征来区分。
图5. 位于智利的阿塔卡马沙漠沿海洞穴内，Cyanidium在岩壁上形成生物膜。（Azúa-Bustos et al., 2009）
（1）Cyanidioschyzon merolae：细胞较小，大小为1.5 ~ 3.5μm，呈椭圆形、棒状。没有细胞壁，含有一个多态叶绿体和一个线粒体，通过二元裂变进行繁殖。这个物种是一个严格的自养生物，只能通过光合作用进行生长繁殖，被认为是最原始的真核微藻。但有研究发现，经过遗传改造后，该藻也能利用有机碳源进行异养或兼养。
图6. C. merolae细胞分裂过程图解（Misumi et al., 2005；Miyagishima & Tanaka，2021）
（2）Cyanidium caldarium：细胞大小为2-5μm，呈球形，被富含蛋白质的细胞壁包围。它们包含一个单一的球形叶绿体和一个凹的线粒体，并通过形成4个内生孢子繁殖，类似C. merolae，该种也限制于光养生长。
（3）Galdieria sulphuraria：细胞球形，细胞较大，可达11 μm。它有细胞壁，一个杯状的叶绿体，一个线粒体和一个液泡，并通过形成4-32个子细胞增殖。该种是兼性异养生物，当环境条件限制了光合作用时，能够利用有机化合物作为碳源。
图7. 三种不同营养方式下的G. sulphuraria SAG 107.79（Amanda M. Davis，et al., 2016）
【研究认为Cyanidioschyzon属可能是宿主嗜热细胞(类热原体的太古代微生物) 和一个小蓝藻之间结合的结果，或者一个宿主古细菌吞噬一个嗜热小蓝藻，而后演化出Cyanidium属，具有厚实的细胞壁，而后者进一步分化成Galdieria属的各个分支】
图8. (A) 意大利托斯卡纳Larderello的岩石内和(B)那不勒斯Pisciarelli的青绿藻。箭头表示在这些地点的岩石内部繁盛的青绿藻生物群落。右上角电镜图像分别显示了两种Galdieria的细胞结构，比例尺= 1 μm。（Yoon et al., 2006）
这三种藻的营养方式与其生境可以对应起来, C．caldarium和C. merolae主要是在岩石表面发现的，而G. sulphuraria则是从岩石更内层中分离出来，这个部位阳光穿透不足，迫使细胞转向异养。
图9. 美国黄石国家公园里的青绿藻：（a）酸性温泉溪流中形成的藻苔/藻垫，（b）在沉积岩的表壳及表壳下的青绿藻，（c）硫磺烟雾中的岩石表面生长的青绿藻。（Valérie Reeb & Debashish Bhattacharya，2010）
（二）基因组信息
C. merolae和G. sulphuraria，的全基因组测序在十多年前即已完成。与其他光合生物相比，C. merolae的基因组信息独特而简单，20个染色体、16.5 Mbp，辨析出5331个基因，至少86%可表达（4775个编码蛋白基因），遗传冗余度很低，仅有26个基因带有内含子。包含有最小的rRNA基因集，在三个不同的位点上有三个拷贝，产生一个小核仁，没有核仁相关染色质。由于C. merolae结构和基因组成简单，它为研究光合作用真核生物的起源和进化，以及自由生活的真核细胞生存所必需的基本机制提供了极好的模型。
C. merolae的线粒体基因组大小为32.2kb， 包含35个编码蛋白的基因和28个RNA基因，为已知红藻种类中最大的线粒体基因组；红藻的叶绿体基因组为光合作用真核物种里基因最丰富的类群，C. merola叶绿体基因组中含234个基因，其中208个基因编码蛋白。
G. sulphuraria 的全基因组测序启动于2004年，基因组仅15 Mbp，42条染色体，大约50%的基因带有内含子，显示典型的剪接体特征。与C. merolae相比，有30%的基因不具同源性，差异验证了这两种藻的深度分化，以适应不同的极端环境。
另有研究发现，G. sulphuraria中约5%的基因是通过水平基因转移从古细菌中获得的。这些基因直接与G . sulphuraria适应其自然栖息地严酷条件如高温、低pH值和高浓度的盐和金属等环境的各个形状相关。
（三）异养特性
G. sulphuraria具有异养营养的能力，可以利用包括各种单糖、糖醇、有机酸和氨基酸等物质的几十种（50+）有机碳源异养培养或兼性营养，它能耐受浓度高达166 g/L的葡萄糖和果糖、22 g/L (0.17 M)的硫酸铵、1-2 M的总盐浓度、pH值小于1，在连续补料培养的情况下，生物量可达80-110 g /L（藻蓝蛋白含量为250/400 mg /L）。（Schmidt et al.，2005），还有一个生产优势是，前述的发酵参数可以很大程度上杜绝其他菌种的污染，降低生产难度。
图11. 光养（A）和异养（B）条件下G. sulphuraria 细胞电镜照片，可以观察到异养条件下叶绿体（CP）的缺失，转化为前质体，并出现个大液泡（V），（Martínez García, 2017）
G. sulphuraria在“光照+有机碳源”的方式下，在室外以板框式反应器（光程10cm）为养殖装置，设置pH=2.5，利用蔗糖为碳源进行兼养，指数阶段生物量增长速度可以达到1g/L/天。
图12.亚利桑那州立大学进行的G. sulphuraria室外培养实验。
C. merolae的细胞壁非常薄或者无，一方面容易进行基因改造，另一方面可以利用渗透压变化进行简单有效的细胞提取，因而在生物合成学领域或许为一个良好的底盘藻株。
（一）模式生物与先锋生物
本身作为先驱真核细胞——“嗜极藻”， 它们所处的恶劣环境可能类似于地球上最初的情况，是研究地球生命起源和演化的材料：例如诸多恶劣条件适应的问题、内共生/细胞器、有机大分子演化等真核细胞的起源相关的问题等等。基因组小而简单，容易进行转基因或基因编辑操作，适合作为研究基因功能的材料。同时它又是一种开拓无生命区域的先锋生物，也是构建先锋生物所需的耐酸、耐高温、耐高盐等基因资源的有效而丰富库藏。
图13. 位于冰岛东南部Hekla的Landmannalaugar（兰德曼纳劳卡高地），为欧洲著名的温泉区域。该处分离得到的为G. sulphararia和G. maxima。
（二）环保
青绿藻目生活在各种各样的环境中，包括热硫磺泉、溪流、 泥、岩壁、岩石内等栖息地等。
因此，该类藻多有耐受高浓度二氧化碳能力（G. sulphuraria，10%），且有很高酸性的耐受能力，可以用来解决含有SOx 和NOx 的烟道气生物净化。
图14. 黄石国家公园中的青绿藻藻苔。(a)诺里斯间歇泉盆地（Norris Geyser Basin）龙泉（Dragon Spring）里狭窄的绿色藻带。(b)位于圆形剧场温泉地区（Amphitheater Springs area）的柠檬溪（Lemonade Creek）里的藻苔。
C．caldarium可以耐受高达200mM浓度的铝离子。
尤其如G. sulphuraria，自养/异养/兼养皆可，且可利用碳源广泛，具有耐高温/强酸/高盐/有毒重金属的特性，因此具有良好的废水处理能力，研究发现在 大型户外生物反应器中，该藻对城市污水中氨氮(88.3%)和磷酸盐(95.5%)的去除效果非常好。此外，许多元素，包括金、钯、铂等贵金属以及镧系元素（稀土元素），可以被该藻在很低的元素浓度下并有诸多不利理化条件（强酸/有毒重金属如镉、汞、铝和镍，放射性元素铯等）的情况下实现有效的生物吸附，甚至可以直接从矿渣等固体上实现生物吸附，因而可以用于生物采矿。
图15. 新墨西哥州州立大学以G. sulphuraria为材料，进行消减污水N、P的研究
Čížková 等（2020）将节能灯（CFL）和荧光灯（FL）内的发光材料添加至G. phlegrea的培养液中，以甘油为碳源进行光照培养，发现该藻能富集发光材料中的稀土元素，积累最多的元素是钇，其次是铕和镧，而且在适宜浓度下，发光材料还能在增加藻体中的叶绿素含量（见下图）。
图16. G. phlegrea，利用实验光反应器（立管）为装置，添加1%甘油进行兼养，发光物质添加量分别为100/200/300mg/L，上图为培养2天的情况，下图为培养5天的结果，
总体而言，该领域的应用可推广至废物/废水处理，金属回收行，生物修复等行业。
（三）活性物质与食品/医药开发
（1）食品应用
以G. sulphuraria为例。G. sulphuraria食用的安全性已经得到实验验证（Graziani et al., 2013，Modeste et al., 2019），其富含藻蓝蛋白的提取物已经通过美国FDA的GRAS认证（GRAS Notice (GRN) No. 1000，2021）。G. sulphuraria细胞中富含蛋白质(26-32%)和多糖(63-69%)，脂质含量较低，在异养条件下，脂质部分主要含有单不饱和脂肪酸。色素类物质以藻蓝蛋白为主，光养或异养均有，光养条件下以别藻蓝蛋白（allophycocyanin）为主，异养条件下以藻蓝蛋白（phycocyanin）为主，在光养的条件下还有叶绿素a和类胡萝卜素可检测到。
G. sulphuraria作为食品原料的优势在于：第一，可以利用甘油的低价碳源为生产原料进行高密度发酵生产，发酵的污染控制难度低；第二，虽然该藻中的蛋白和多糖结合紧密，不易消化，但是已经有相应的酶制剂可以解决这个问题，成为蛋白和膳食纤维的优质原料；第三，发酵条件下叶绿素含量低、脂肪含量低，延长了产品货架期（变色、脂肪氧化导致腥味臭味）。
图17. 美国FDA关于G. sulphuraria提取物的安全性备案
（2）多糖
多糖是红藻的一个非常有特点的产物。如大型红藻麒麟菜生产的卡拉胶，作为胶凝剂和增稠剂广泛应用于各种食品中，卡帕藻的多糖提取物应用于多种化妆品，如单细胞红藻紫球藻的多糖，更具有诸多生物活性作用。
Floridean starch（佛罗里达淀粉或者红藻淀粉）是红藻合成的能量储存多糖的名称，它名字来源于分类学名词Florideophyceae，红藻淀粉与其他植物淀粉的区别在于，它的合成和存储发生在细胞的胞浆中，并以UDP葡萄糖为供体，而其他植物淀粉或糖原相应的部位在质体中，且以ADP葡萄糖为供体。红藻中多数种类的红藻淀粉为支链淀粉，而在C. merolae中的红藻淀粉称为半支链淀粉（semi-amylopectin），因长链 (DP≥37)和短链(DP≤8)的比例而决定。这种半支链淀粉葡聚糖以低结晶度的小颗粒的形式储存，不含直链淀粉，与其他红藻相比显示出更高的糊化温度，推测作用为C. merolae居住在高温环境中提供颗粒稳定性的优势。
C. merolae作为最原始的青绿藻目物种，也是所有光合作用真核生物中最原始的物种——积累半支链淀粉的事实支持了红藻、绿藻和植物的单一共同祖先最初在细胞质中积累淀粉作为存储多糖的假设。之后，由于环境的压力，C. caldarium和G. sulphuraria的存储多糖已经变化为糖原，这两个属的多糖也类似前者，不形成不溶性结晶颗粒。
G. sulphuraria糖原的链长分布具有非常显著的特征，其中DP 4-10链占多数，DP值为9的链最为丰富，DP≥15的链几乎不存在。在异养（以甘油为碳源）的条件下合成的糖原，是迄今为止报道的支化程度最高的糖原，具有18%的α-(1 / 6)键，而且它只由短链组成，分子量和粒径小得多。另有报道，同属的G. maxima也可以合成高度分支的糖原。高度分支的糖原对于藻体的作用有可能是帮助细胞耐受高渗透压，另外高支化糖原的降解率低，可以使细胞在很长一段时间内保持能量供应，尤其是对应G. sulphuraria能够在完全黑暗的环境中存活很长时间的特性。
图18. 佛罗里达苷/甘油半乳糖苷（2-O-α-D-galactopyranosylglycerol）和甘油葡萄糖苷（2-O-α-D-glucopyranosylglycerol），注意佛罗里达苷与甘油葡萄糖苷在分子构象上的差异，佛罗里达苷是红藻光合作用的主要产物，佛罗里达苷是红藻为动态碳库，在同化为多糖分子（淀粉/糖原/细胞壁多糖）之前被暂时存储。
C. merolae和G. sulphuraria生产的这类多糖或者衍生物（高支化糖原、佛罗里达苷/甘油半乳糖苷）有其商业利用价值，如已经有利用其他原料（玉米淀粉）合成类似结构的多糖应用于腹膜透析溶液（美国Baxter Healthcare公司）和以及作为运动饮料/食品（日本Glico公司）。另外还有些相类似多糖的衍生物用于食品、药物、化妆品或环保材料开发的研究，在此不赘述。结合发酵技术，利用青绿藻生产高支链糖原/淀粉，不失为一种廉价的和高效的生产方法，并可在很多领域替代传统的淀粉原料。
（3）藻蓝蛋白
在本系列前一篇中，已经有过关于螺旋藻藻蓝蛋白的叙述。青绿藻目中，同样含有藻蓝蛋白。
G. sulphuraria在跑道池培养，干重可达到2.37 g/L，藻蓝蛋白含量可达到10%以上（Wang et al., 2020）；G. sulphuraria在黑暗环境下发酵培养依然能够产生藻蓝蛋白，无光异养的情况下，用限碳供氮的方法，G. sulphuraria中藻蓝蛋白的含量可以达到8-12mg/g，以80μM ㎡/s 光量子密度处理甘油培养的细胞，藻蓝蛋白含量可以提升到20mg/g，更有实验处理可以达到28 mg/g（Sloth et al., 2005）。利用发酵罐培养作为种子液，再经过室外培养，可以达到13%的藻蓝蛋白含量（Wan et al., 2016）。
Graverholt & Eriksen（2007）的利用一株高色素变异株为研究材料，发现在补料培养的条件下，不仅生物量可以达到80-110g/L，培养液中藻蓝蛋白的含量可以达到1.4-2.9g / L，产率为0.5 -0.9 g/L/天，这是一个相当高的产率，虽然在含量上低于螺旋藻，增加了提取的成本，但是考虑到原料生产的稳定性，依然很大的商业优势存在。
G. sulphuraria中提取的藻蓝蛋白，变现为在宽pH值范围内稳定，在pH值5-7之间达到80℃依然不变性，经细胞水平验证，具有抗癌和抗氧化的活性，即使经过高温处理蛋白变性后，依然具有相应的生物活性。
图19. 不同pH值下，G. sulphuraria藻蓝蛋白的显色情况，脱色主要原因为发色团脱落（Ferrar et al., 2018）
另有研究发现，从C. merolae中提取获得的藻蓝蛋白具有更好的耐光辐射和耐热性。耐热实验中， pH=5条件下的（蛋白）变性中点为83℃，而来自螺旋藻的藻蓝蛋白仅为65℃。耐酸和耐高温等属性使得青绿藻来源的在食品或者其他领域的应用具有巨大的优势。
世界香料香精巨头奇华顿旗下的DDW公司是一家总部位于美国肯塔基州的天然色素公司，在行业内有相当的知名度。近期DDW和法国Fermentalg公司合作，正在研发一款从发酵的G. sulphuraria中提取生产的藻蓝蛋白产品BLUE ORIGINS® ，产品的品质在沾染、扬撒、溶解性、耐热、耐光辐射和耐酸（2.8-7.0）方面等多个方面优于螺旋藻来源的产品。
图20. DDW公司从发酵G. sulphuraria中提取的藻蓝蛋白产品。
（4）医药
Carfagna等（2015）在大鼠日粮中添加G. sulphuraria，发现该藻具有减少运动相关的氧化损伤和线粒体功能障碍的功效，并对其他如甲状腺功能亢进、慢性炎症和缺血/再灌注等症状导致的氧化应激有改善效果，推测可能与G. sulphuraria含有较丰富的藻蓝蛋白和含硫谷胱甘肽相关。
Bimonte等（2016）的研究发现G. sulphuraria的水提物具有抑制5-α还原酶的功能，并能诱导β-防御素的表达（抗菌），促进（皮肤细胞的）伤口愈合过程。通过人体临床实验，证实了其调节皮脂生产的能力，因而具有开发为化妆品的潜力，尤其是针对油性和脂溢性皮肤的产品。
（5）其他
Çalışkan等（2019）利用Galdieria藻对金属的吸附效益，以异养培养的Galdieria. sp制备了银、铁(II)和锌纳米颗粒，并检测了这些纳米颗粒对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的抗菌活性。研究发现了制备过程中与微藻培养相关的多个参数对纳米颗粒的形成有重大影响。
图21. 利用Galdieria制备的纳米银颗粒对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都表现后抗菌活性。
以本文所述的三个属为关键词，NCBI库中六十年来文献总数600多篇，近几年处于高峰期，但每年数量也没有超过40篇，可以说这么多年青绿藻这个门类一直被主流忽略。
青绿藻单纯在种质资源收集上就有很大空间，还有诸多的火山、温泉等区域未经调查，种株特性上了解更加少，更不用谈一些细致深入的遗传、生理生化和开发应用的问题。
在科学意义的层面：作为最原始的真核细胞和“嗜极”生物，是一类难得的研究生命起源和地球历史的研究材料，也是人类挑战“星辰大海”的生物和遗传信息资源。
在生产生活领域：优越的环境耐受性、培养的可操作性与所含的生物活性物质，在环保和食品医药等多个领域有发挥的空间。