支原体检查似乎不难但又很偏门，写了似乎没有太大价值。纠结良久总算找到一个写作的理由，分享我学习支原体检查的一个思路然后供大家借鉴-基于历史经验的类比学习法。
一、学习思路分享
1、支原体检查问题地图
中国药典对支原体检查的描述仅有一页纸，可谓是精炼至极。初学时一脸懵逼，似懂非懂，无处下手。盲传两代时干啥？支原体的浓度该是多少，林林总总我想到了很多问题。在将近崩溃的边缘我想到了支原体也是微生物，那么借鉴微生物限度检查的思路是必要的：菌种、培养基、供试品处理、方法适用性和检验等，于是我们得到了问题地图如下。
2、他山之石
有了问题地图，事情变得条例起来，然而该如何把握尺寸呢？我想到的是基础原理和国外法规规定。
关于基础原理，我在前面三部分都有学习，国外法规也有简单对比，此时只对法规条目做简单分享。
二、支原体培养法（中国药典方法）学习过程
1、支原体菌种
关于菌种我想到的就是浓度该是多少和如何制备的问题。
1.1 如何制备？
首先是否可以使用生理盐水？支原体苛养且脆弱，且生理盐水pH对支原体不适宜排除；
中国药典提到的支原体肉汤培养基是广谱培养基，可用于支原体菌悬液的制备，因为制备菌悬浊液时不需要实现增殖故无需考虑精氨酸以来的问题。
1.2 浓度是多少？
支原体菌悬液通常时作为阳性对照。变色实验时可以按照药典规定进行操作制备多个浓度；
日常检验时需要一个相对稳定的浓度不然会增加工作量；
参考欧美药典实验过程中用到的支原体浓度建议不大于100cfu或采用变色实验中呈现生长变色的稀释级别（也就是盲传两代后的10-8或10-4）是两种思路，此时为了保证稳妥个人建议参考中国药典来。
2、支原体培养基的配制及验收
关于培养基的主要问题是如何配制和如何进行验收。
2.1 如何进行配制
按照中国药典规定，培养基：血清=8：2,为了便于操作建议通常配制8mL，如必要时再等比增大培养基体积。
因为血清需要使用时加入故我们配制的是无血清基础培养基。
2.2 如何进行验收
微生物限度培养基我们会进行外观、pH和适用性实验（无菌性和其他）。而药典仅规定了要做变色单位试验。这里的变色单位试验与我们微生物限度检查的促生长试验类似，药典中有明确规定故不再赘述。
外观，因为中国药典方法是通过变色来实现结果判断，因此此项指标很重要，特别注意干粉、预制培养基及加入血清后培养基的颜色。
pH，关乎变色和支原体生长；
无菌性，其他微生物的生长会引起假阳性结果。因为支原体检查长达28天，故建议按照无菌检查20~25℃和30~35℃两个温度分别培养14天，避免假阴性结果；
唠叨一句，药典是普适性的不会事无巨细，我们需要根据我们的目的基于药典进行实验设计。
3、方法适用性实验
中国药典中并未提到相关要求且检查时的样品多为上清液，但是生产方式不同或不同成分的产品均可能引起对支原体的一致，即使继代培养也不一定可以消除抑制。
为了证明不存在抑制我们可以平行进行供试品阳性试验，此时成本过高且风险较大。所以建议借鉴欧美药典进行加入样品进行营养性试验的思路进行试验。
欧洲药典2.6.7提到的实验批次是1批，区别于微生物限度方法适用性试验。个人以为因为存在继代培养所以要求便不完全等同与微生物限度方法适用性试验。
4、支原体实验前的准备
4.1 样品的准备
不同于微生物限度检查样品，如在24小时之内进行支原体检查放置2~8℃保存；如超过24小时样品应放置-20~-30℃保存，注意试验前将样品放置2~8℃或水浴融化。
4.2 灭能无支原体小牛血清的制备
中国药典里面并未提及如何灭能。根据支原体灭活和保证血清稳定可以设定方法，查阅资料得出方法可以是：取适宜支原体生长的无支原体小牛血清室温融化，待水浴温度稳定56℃放入，轻轻摇匀，待水浴箱温度稳定56℃后计时，30分钟后去除，冷却备用。
4.3 培养基的制备
特别注意半流体培养基需要煮沸，此时并无法测试培养基，药典规定冷却至56℃，此时这个温度并不好准确测量。考虑SOP可操作性，个人建议可在降温至56℃左右，上限不超过56℃温度不低于37℃即保证培养基不凝固即可。
其次培养基制备时注意混匀；
再就是按照试验需要提前制备足够的培养基（不仅是样品组、还要包括阴性对照、阳性对照等）。
还有一点支原体肉汤/半流体培养基和精氨酸肉汤/半流体培养基两套都要做——因为我们不清楚是否存在精氨酸依赖的支原体。
4.4 操作前的确认
环境确认、设备确认以及物料耗材的确认，特别是培养基的确认。与其他微生物检查试验无不同都要无菌故不再赘述。
5、支原体检查及注意事项
5.1 试验分组
药典中仅规定了如何做。但是未规定如何做阴性对照和阳性对照。
其中阴性对照选择培养基即可；
阳性对照，因为支原体产酸和产碱两种情况故支原体肉体培养基选择肺炎支原体和口腔支原体两种培养基做阳性对照（说到阳性注意满足生物安全的要求）。
之所以一定要做对照，还是基于最终结果判断不同人员感觉认知不同，是阴性还是阳性需要跟对照组对比确认而不是凭主观判断。
特别强调一点，转接后也要做阴性对照和阳性对照。
再就是每次实验，先做样品和阴性对照，然后做阳性对照
5.2 培养过程
培养条件，中国药典未做规定。欧美药典要求液体密封的可以不在二氧化碳培养箱中培养。故做好密封在36±1℃条件下培养即可。
6、结果判断
跟微生物限度检查一样，先判断试验有效然后再判断是否符合。
阴性对照颜色变化且无支原体生长、阳性对照呈相应的阳性结果（分别产酸或产碱）时实验有效。
然后结果判断同药典规定一样去判断即可。
为了避免复试，建议提前做方法适用性和培养基的适用性检查。
三、其他
1、指示细胞培养法（也叫DNA染色法）的简略说明
DNA染色法也是极其简练的。其中我们需要攻略溶液配制和细胞的培养、消化、传代。其中溶液配置后注意染色液避光保存、部分溶液现配现用和酶溶液再37℃复温。细胞培养部分参考细胞培养的要求。特别注意DNA染色法也要涉及阴性对照和阳性对照。
2、基于NAT的法规规定
其他的快速测定方法，个人没有实操经验仍在学习中。一下是个人借鉴罗氏诊断《生物制药的支原体检测：当前的监管、挑战和趋势从传统培养到基于NAT的自动化高通量检测的转变》一文的小结，具体实操经验待后续研究明白再分享。
小结
学习支原体检查的初期个人下载了很多参考文献，但是发现越看越乱。最后对比微生物限度检查检验和问题地图总算是梳理好思路。现在回头来看，药典中很多规定并不具体，为了确保试验的顺利有效开展，我们有必要结合实验设计的思路进行流程优化。以上是个人思考，纸上谈兵定有不足，恳请智友不吝赐教。
参考资料下载
聂教授
新型纤维及复合材料制备技术
博士
洪教授
医学影像诊断技术
硕士
陈教授
建筑业
博士
郑教授
其他
博士
陈教授
现代农业
本科
肖教授
其他
博士
倪教授
生物治疗技术和基因工程药物
博士
吕教授
循环流化床燃烧理论与技术生物质燃烧煤粉燃烧与气化燃烧过程中污染物控制气液两相流与水动力
博士
张教授
输电技术
博士
预算：5000万元
山西 运城市 闻喜县
预算：面议
山东 淄博市
预算：面议
四川 眉山
预算：面议
陕西 西安市 莲湖区
预算：面议
广西壮族自治区 桂林
预算：面议
广西壮族自治区 桂林
基于信息中介 —— 专项服务 —— 全程代理的发展路径，为技术经理人提供培训认证、备案管理、业务支撑等服务，为区域培养一支专业化程度高、服务能力强的技术经理人队伍。
[政府园区]
应用数据可视化技术，制作科技项目、科技成果、科技人才、典型案例等的科技活动周专题展示。
[政府园区]
科技特派员在线登记、日志填写、技术需求推送、业绩提交审核、推优评审的工作平台。
[政府园区]
促进高校、科研院所等的科技成果、技术能力向产业、企业进行转移转化与应用服务对象：高等学校、科研院所、大型企业
[高校院所]
用于评价企业智能制造当前状态的工具、建立智能制造战略目标和实施规划的框架，描述了智能制造的核心要素、特征，以及等级演进的路径，为企业持续提升智能制造核心能力提供参考，为评价智能制造水平提供依据。