本发明涉及家禽传染病防疫技术领域，具体涉及一种副鸡禽杆菌的保护性抗原、及其表达和应用。
背景技术：
鸡传染性鼻炎(avianinfectiouscoryza)是由副鸡禽杆菌(avibacteriumparagallinarum，apg)感染引起的禽类最重要的呼吸疾病之一。发病鸡主要表现为流涕、眼睑肿胀以及溢泪等临床症状。鸡传染性鼻炎可以导致鸡产蛋期延迟、产蛋量降低，从而给养殖户造成重大经济损失。
apg属于巴氏杆菌科的短小革兰氏阴性杆菌，基本特征为无运动性、菌体呈多形性、其中强毒株带有荚膜。page等人将apg分为a、b和c三种血清型，研究表明apg的三个血清型均有不同程度的致病能力，但三者灭活菌体间不存在型间交叉免疫保护作用，即接种一种血清型的apg并不能避免另外两种血清型的apg的感染。
为了预防鸡传染性鼻炎肆虐，目前广泛使用apg的灭活疫苗，这些疫苗是通过以福尔马林、硫柳汞等为防腐剂灭活apg而获得的。目前国际上普遍使用的apg灭活疫苗绝大多数囊括a型和c型。随着大量b型的apg在国内外陆续发生和流行，国际上已有较大的疫苗公司开始提供包含a、b、c三种血清型的三价灭活疫苗。由于副鸡禽杆菌属于苛生菌，培养成本高导致常规灭活菌苗成本居高不下；此外，副鸡禽杆菌含有脂多糖(lipopolysaccharide，lps)等毒素物质，大量接种带来的毒副作用会影响鸡生长与产蛋，同时会导致接种的鸡中形成局灶性的坏死斑。鸡传染性鼻炎灭活疫苗对野外鸡群的预防效果约为70-80％，但在其效力检验中由于环境和评价方法的差异可能会有不同的结果。
为了研发更为安全有效的疫苗，有学者进行遗传重组技术制备重组疫苗的研究。例如，ryuichisakamoto等人通过克隆表达副鸡禽杆菌a型和c型的外膜蛋白，获得重组蛋白可用于分别抵抗鸡传染性鼻炎a型和c型感染的保护性抗原。然而，在设计用于制备疫苗的重组抗原时，由于筛选apg三种血清型共有且具有中和活性的抗原表位存在一定难度，能同时抵抗副鸡禽杆菌a、b、c三种血清型保护性抗原鲜有报道。另外，大肠杆菌原核表达的重组蛋白含有大量内毒素，重组蛋白用作抗原时必须要有专门的去除工艺与之配套，费时、费力，操作难度大。
技术实现要素：
为了解决上述技术问题，本发明的一个目的是提供了一种用于副鸡禽杆菌的保护性抗原，利用该抗原制备的疫苗能同时有效预防副鸡禽杆菌的a、b、c三种血清型病原菌感染家禽。本发明的另一个目的是提供副鸡禽杆菌的保护性抗原的表达载体及其表达的重组乳酸乳球菌，其有别于大肠杆菌表达系统，内毒素含量低。本发明的再一目的是提供副鸡禽杆菌的保护性抗原的应用。为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：
一种副鸡禽杆菌的保护性抗原蛋白，所述抗原蛋白的氨基酸序列如seqidno.1所示。
一种编码如上所述的保护性抗原蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如seqidno.2所示。
一种用于表达副鸡禽杆菌的保护性抗原的表达载体，所述表达载体中插入有如seqidno.2所示的核苷酸序列。
如上所述的表达载体，优选地，所述表达载体为乳酸乳球菌表达载体。进一步地，所述表达载体为食品级表达载体pnz8149。
一种用于表达副鸡禽杆菌的保护性抗原的重组菌，所述重组菌含有如上所述的表达载体。
如上所述的重组菌，其原始细胞为食品级乳酸乳球菌。
一种用于表达副鸡禽杆菌的保护性抗原的重组菌的制备方法，包括如下步骤：
(1)、将目的片段la2与质粒puc-57经双酶切和回收后，进行连接，构建puc-57-la2载体；其中，所述目的片段la2的核苷酸序列含有如seqidno.2所示序列及限制酶ncoi和saci的酶切位点；
(2)、分别用限制酶ncoi和saci双酶切所述puc-57-la2载体及表达载体pnz8149，回收纯化酶切片段，并用t4dna连接酶进行定向连接，连接产物用于电穿孔法转化乳酸乳球菌nz3900菌株感受态细胞；
(3)、采用elliker选择培养基对所述步骤(2)转化后的感受态细胞培养，筛选阳性转化菌，鉴定其核苷酸序列如seqidno.2所示，则所述阳性转化菌为制备的用于表达副鸡禽杆菌的保护性抗原的重组菌。
如上所述的制备方法，优选地，所述目的片段la2的获得是通过采用如seqidno.3和seqidno.4所示的引物对序列对如seqidno.2所示的核苷酸序列为模板进行pcr扩增获得。
如上所述的制备方法，优选地，所述双酶切所用的酶为限制酶ncoi和saci。
如上所述副鸡禽杆菌的保护性抗原蛋白在抵抗鸡传染性鼻炎中应用。
本发明的有益效果为：
本发明所得的抗原蛋白，其氨基酸序列如seqidno.1所示，通过抗原特性进行实验分析，westernblotting实验证明本发明所得的重组抗原蛋白具有较强的免疫原性；使用该抗原蛋白免疫试验鸡后能保护试验鸡不受副鸡禽杆菌感染，作为副鸡禽杆菌的保护性抗原蛋白。并通过免疫实验，其实验数据证明，本发明所得的抗原蛋白可对针对多株不同血清型的副鸡禽杆菌产生免疫保护作用，如hp8、221、0083、bj、222、668、modesto等a型、b型和c型apg菌株，且保护效果优于全菌灭活疫苗。
附图说明
图1为表达载体puc-57-la2的构建示意图。
图2为la2基因pcr扩增产物电泳图。
图3为乳酸乳球菌表达载体pnz8149-la2的构建示意图。
图4为阳性菌nz3900/pnz8149-la2的pcr鉴定电泳图。
图5为nz3900/pnz8149-la2重组乳酸乳球菌sds-page筛选不同诱导剂浓度图。
图7为nz3900/pnz8149-la2重组乳酸乳球菌westernblots检测la2蛋白免疫活性图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例来说明本发明内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
在大量实验和经验基础上，根据编码如seqidno.1所示氨基酸序列的基因，人工设计合成适合于乳酸菌表达偏好的核苷酸序列，经过优选适合于乳酸菌表达的优势密码子，确定编码如seqidno.1所示氨基酸序列的基因如seqidno.2所示，即副鸡禽杆菌la2基因序列。通过在乳酸乳球菌表达载体中插入该外源基因(seqidno.2)，并将载体转入乳酸乳球菌，实现外源蛋白在乳酸乳球菌中的表达。
下面通过具体实施例来说明本发明，其中，所用试剂和材料及配置可采用如下：
(一)本发明的实施例中使用的细菌菌株和质粒
lactococcuslactisnz3900菌株(lacf-，pepn::nisrnisk)购自荷兰nizofoodresearch(kernhemseweg,netherlands)。采用含150ml/l甘油的gm17培养基于-80℃保存该菌种。
lactococcuslactis表达载体pnz8149购自荷兰nizofoodresearch(kernhemseweg，netherlands)。pnz8149含启动子pnis、lacf基因、多克隆酶切位点、复制子repc和repa及终止子等元件，为食品级安全性表达载体。
(二)本发明实施例中涉及实验所用培养基的配制
(1)lb培养基
lb液体培养基：称取1.0g胰蛋白胨，0.5g酵母浸粉，1.0g氯化钠，溶于100ml蒸馏水中，用10mol/lnaoh调ph值至7.2，121℃高压灭菌20min，置4℃保存备用。
lb固体培养基：称取1.0g胰蛋白胨，0.5g酵母浸粉，1.0g氯化钠，1.5g琼脂粉，溶于100ml蒸馏水中，用10mol/lnaoh调ph值至7.2，121℃高压灭菌20min，冷却至约50℃时倾注平板备用。
(2)乳酸菌培养基
gm17培养基：称取4.25gm17培养基，溶于80ml蒸馏水中，用10mol/lnaoh调ph值至7.2，定容至100ml，121℃高压灭菌20min，冷却后加入乳糖至终浓度为5.0g/l。
gm17培养基平板：称取4.25ggm17培养基，1.5g琼脂粉，溶于80ml蒸馏水中，用10mol/lnaoh调ph值至7.2，定容至100ml，121℃高压灭菌20min，冷却至约60℃时加入乳糖至终浓度为5.0g/l，混匀后将培养基倒入培养皿中，制成培养基平板。
gsgm17培养基：称取85.50g蔗糖，12.50g甘氨酸，18.63gm17培养基，溶于400ml蒸馏水中，用10mol/lnaoh调ph值至7.2，定容至500ml，高压灭菌。冷却后加入葡萄糖至终浓度为5.0g/l。
gm17mc恢复培养基：称取3.73gm17培养基，0.19gmgcl2，0.02gcacl2，溶于80ml蒸馏水中，用10mol/lna0h调ph至7.2，定容至100ml，高压灭菌。冷却后加入葡萄糖至终浓度为5.0g/l。
elliker选择培养基配制方法如下：
(1)4.0g/l溴甲酚紫储藏液：称取0.4g溴甲酚紫，溶于5％的乙醇，用0.1m的naoh调ph值至8.0,定容至100ml。用无菌0.22μm孔径过滤器过滤除菌，4℃保存备用。
(2)200g/l乳糖储藏液：称20g乳糖，用蒸馏水定容至100ml，用无菌的0.22μm孔径过滤器过滤除菌，分装，-20℃保存备用。
(3)取0.50g酵母浸粉(yeastextract)，2.0g胰蛋白胨(tryptone)，0.15g无水醋酸钠，0.40g氯化钠(nacl)，1.5g琼脂粉(agar)，0.05g抗坏血酸，溶于100ml蒸馈水中，高压灭菌20min。冷却至约60℃时，加入lml4.0g/l溴甲酚紫储藏液(终浓度为40mg/l)和2.5ml的200g/l乳糖储藏液(终浓度5.0g/l)，倾倒平板，4℃保存备用，三天内使用。
(三)本发明实施例中涉及实验所使用的试剂
m17培养基(青岛海博生物技术有限公司产品)、氯霉素(美国amresco公司)、t4dna连接酶和限制性内切酶ncoi、saci(美国fermentas公司)、凝胶回收试剂盒(杭州爱思进(axygen)生物科技有限公司)、高纯度质粒提取试剂盒和dnamarkeriii(北京康为世纪生物科技有限公司)、pcr反应试剂盒和rna酶(rnasea)(北京天根生化科技有限公司)、其他常用试剂均为国产分析纯级试剂。
实施例1克隆载体puc-57-la2的构建
puc-57-la2克隆载体的构建示意图如图1所示，具体操作步骤如下：
1.1pcr引物设计与合成
对实施例1中的副鸡禽杆菌la2基因序列，即如seqidno.2所示，进行全基因合成。并利用生物软件primer5.0设计pcr引物，上游引物序列为(seqidno.3)：5'-catggctggcacagagcgtaaaaaccaacttt-3'；下游引物为(seqidno.4)：5'-tcgagatttgcggtggttgcaccgccttgggt-3'。在上游引物5'端引入ncoi酶切位点，在下游引物5'端引入saci酶切位点。目标产物长度为1702bp。引物及副鸡禽杆菌la2基因序列由上海生工生物工程有限公司合成。
1.2la2基因的pcr扩增
(1)参照pcr反应试剂盒(北京天根生化科技有限公司)产品说明，配制20ul反应体系：10μmol/l的上游引物lμl，10μmol/l的下游引物lμl，2×taqpcrmastermix10μl，副鸡禽杆菌la2核苷酸模板2μl，加去离子水至20μl。
(2)循环条件：预变性95℃：5min，95℃：1min，56℃：1min，72℃：1min，30个循环，最后72℃延伸10min。
(3)pcr产物分析：取5μlpcr反应产物，于0.1g/l琼脂糖凝胶中电泳，电压为100v/cm，用dnamarker做分子量标记，电泳20min后，用凝胶图像扫描仪进行分析。
1.3puc-57质粒提取
(1)收集振荡培养过夜的含有puc-57质粒的重组大肠杆菌菌液5ml，取1.5ml菌液于离心管中，室温12000×g离心1min，弃去上清。重复进行操作。
(2)向离心管内加入250μlbufferp1，重悬沉淀。
(3)向离心管内加入250μlbufferp2，轻轻地上下颠倒离心管数次，室温放置2min，至菌体完全裂解，溶液变的黏稠清亮。
(4)向离心管内加入350μlbuffern3，立刻轻轻地上下颠倒离心管数次，使液体充分混匀，至白色絮状物沉淀出现。室温12000×g离心10min。
(5)将上清转入带有2ml收集管的吸附柱内，室温12000×g离1min，弃废液，再将吸附柱放回收集管。
(6)向吸附柱内加入bufferpb500μl，室温12000×g离心1min，弃去废液，再将吸附柱放回收集管。
(7)向吸附柱内加入bufferpe750μl，室温12000×g离心1min，弃去废液，再将吸附柱放回收集管。
(8)空转吸附柱。室温12000×g离心2min，使dna吸附柱干燥。
(9)将吸附柱放入一个高压灭菌的1.5ml离心管内，在柱内硅胶膜中心位置加50μl灭菌蒸馏水，避免触及硅胶膜，室温静置4min，室温12000×g离心1min，弃掉dna吸附柱，离心管中的液体就是克隆质粒puc-57。
1.4la2基因与质粒puc-57的双酶切与回收
取步骤1.2中pcr扩增得到la2基因，用限制性内切酶saci和ncoi进行双酶切，并用saci和ncoi双酶切质粒puc-57。酶切体系为：saci1μl、ncoi1μl、10×cutsmartbuffer2μl、质粒puc-57或la2基因16μl。37℃酶切0.5h。用凝胶回收试剂盒(杭州爱思进生物科技有限公司)对酶切片段分别进行纯化回收，操作步骤如下：
(1)取50μl双酶切产物在2％(w/v)的琼脂糖凝胶中电泳20min，依据dnamarker条带的位置，在紫外灯下切下含有目的片段的琼脂糖凝胶，用滤纸将凝胶表面液体吸干，然后装入1.5ml的洁净的1.5mlep管中，称凝胶重量，根据重量估算凝胶体积(l00mg的凝胶按100μl体积估算)。
(2)加入3个凝胶体积的bufferde-a，混合均匀后于75℃水浴，间断混合，直到凝胶完全溶化。
(3)加入0.5个bufferde-a体积的bufferde-b，混合均匀。
(4)将步骤(3)的混合液转移至dna制备管中，12000r/min离心lmin，弃滤液。
(5)将制备管置回2ml离心管，加500μlbufferwl,12000r/min离心30s，弃滤液。
(6)将制备管置回2ml离心管，加700μlbufferw2，12000r/min离心30s，弃滤液。以同样的方法再用700μlbufferw2洗涤一次，12000r/min离心lmin。
(7)将制备管置回2ml离心管中，12000r/min离心lmin。
(8)将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，在制备膜中央加30μl去离子水，室温静置lmin。12000r/min离心2min洗脱dna，将得到的dna置-20℃保存。
1.5la2基因与质粒puc-57的定向连接
将步骤1.4回收的la2基因与puc-57质粒用t4连接酶于16℃进行连接反应16h。连接反应体系：t4dna连接酶lμl、puc-573μl、la21μl、10×buffer1μl。16℃连接反应16h。
1.6puc-57重组质粒的转化
(1)将上述1.5中孵育过夜(16h)后的10μl连接产物加入200μldh5α感受态细胞(购自北京天根生物科技有限公司)中混匀，冰浴30min；
(2)42℃热激90s，迅速置冰浴2min；
(3)加入800μllb液体培养基混匀后，37℃200rpm振摇培养1h，使细菌恢复正常生长状态；
(4)取100μl菌液涂布于预涂iptg及x-gal的amp筛选平板上，37℃培养12-18小时，挑取白斑菌落，接种于5ml含100μg/mlamp+lb试管中。
1.7重组质粒dna的提取
从amp+/lb固体培养基上挑取白色单菌落，接种于5rnlamp+/lb液体培养基中，37℃200rpm振摇培养过夜。根据qiagen公司qiaprepspinminiprepkit试剂盒说明书提取重组质粒质粒(方法如1.3所述)。
1.8重组质粒的酶切和pcr鉴定
(1)将上述提取的克隆质粒，取1μl作为模板，进行pcr鉴定，反应体系为：
组分la2模板即上述步骤1.7中的克隆质粒1μl，2×taqpcrmix10μl，f(10mmol)1μl，r(10mmol)1μl，ddh2o7μl，总体积20μl。
瞬时离心混匀，于pcr仪中扩增。反应条件为：95℃预变性5min后进入pcr循环，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1.5min，30个循环，最后72℃延伸10min。反应结束后，取5μl产物用1％琼脂糖凝胶电泳观察，能扩增出与目的片段大小相符的质粒鉴定为阳性。
(2)将上述步骤1.7中所提取的质粒，用ncoi、saci双酶切，酶切反应体系如下：
重组质粒dna10μl，10×fastdigestgreenbuffer2μl，kpni1μl，psti1μl，ddh2o6μl，总体积20μl。轻轻混匀以上组分，37℃水浴30min，取5μl酶切产物用1％琼脂糖凝胶电泳观察，能切出目的片段和puc-57载体大小的质粒鉴定为阳性。
将菌液pcr及双酶切鉴定均为阳性的克隆过夜培养，送生工生物工程股份有限公司测序。用dnastar软件分析插入目的序列与参考序列的核苷酸和氨基酸同源性及碱基顺序正确性。序列正确的质粒分别命名为puc-57-la2。
结果如下：
1.副鸡禽杆菌la2的pcr扩增结果
pcr扩增la2基因产物在1％琼脂糖凝胶中的电泳结果显示，pcr扩增产物的长度与预期的长度(1702bp)符合，具体如图2所示，其中，图中1为dnamarker(bp)，2为以副鸡禽杆菌为模板pcr扩增la2基因的产物，3为阴性对照；证实pcr扩增la2基因成功。
2.阳性转化菌的筛选结果
用puc-57与la2连接产物热激及冰浴后，加入lb培养基恢复培养1h，取100μl菌液涂布于预涂iptg及x-gal的amp筛选平板上，37℃培养12-18小时，挑取白斑菌落，接种于5ml含100μg/mlamp+lb试管中，可见培养基上有白色的阳性转化菌落。
3.阳性转化菌的鉴定
挑取lb培养基上的白色菌落接种到lb液体培养基，培养12h后，提取质粒，pcr鉴定结果为扩增产物长度与预期片段长度(1702bp)相符；将质粒交由北京华大基因公司对质粒中la2基因进行测序，结果得到核苷酸序列与seqidno.2的la2基因序列进行blast比对，结果显示二者相同。结果证明从该阳性转化菌中提取的质粒即为所要构建的重组载体，将该表达载体命名为puc-57-la2，将含有该表达载体的重组菌株命名为：puc-57-la2。采用含150ml/l甘油的gm17培养基于-80℃保存该菌株。
实施例2表达la2基因重组乳酸乳球菌的构建
乳酸乳球菌表达载体pnz8149-la2的构建示意图如图3所示，具体操作步骤如下：
2.1提取乳酸乳球菌pnz8149质粒
从gm17固体培养基上挑取单菌落(lactococcuslactis表达载体pnz8149)，接种于5mlgm17液体培养基中，30℃静止培养过夜。根据qiagen公司qiaprepspinminiprepkit试剂盒说明书提取质粒，步骤同1.4。
2.2克隆载体及表达载体pnz8149的双酶切及回收
用限制酶ncoi和saci双酶切实施例1中制备的重组克隆载体即puc-57-la2重组质粒以及表达载体pnz8149，酶切体系如下：
puc-57-la2重组质粒dna40μl，10×fastdigestgreenbuffer7.5μl，saci3μl，ncoi3μl，ddh2o21.5μl，总体积75μl。
轻轻混匀以上组分，37℃水浴1h，将75μl酶切产物于1％的琼脂糖凝胶中电泳，并参照dna凝胶回收试剂盒说明书回收酶切产物，l％的琼脂糖凝胶电泳观察回收效果，确证酶切成功。
2.3目的片段la2和表达载体pnz8149连接
将凝胶回收得到的目的片段la2分别与乳酸乳球菌表达载体pnz8149的胶回收产物进行连接，连接体系如下：
la2和pnz8149的摩尔比为4-6:l，轻轻混匀，16℃连接过夜。
10×t4dnaligationbuffer1μl，t4dna连接酶1.5μl，la23μl，pnz81494.5μl，总体积10μl。连接产物置于-80℃冰箱中备用。
2.4乳酸乳球菌nz3900感受态细胞的制备
具体步骤如下：
(1)第一天从培养板上挑取单克隆菌体，即lactococcuslactisnz3900菌株接种于5ml液体gsgm17培养基中，30℃静止过夜培养；
(2)第二天将过夜培养的5ml菌体加入50mlgsgm17培养基中，30℃静止过夜培养；
(3)第三天将过夜培养的50ml菌体转400mlgsgm17培养基中，30℃静止培养至od600为0.3左右(大约3h)；
(4)将菌液6000g，4℃离心20min，收集菌体；
(5)用冰冷的400ml的洗液i(0.5m蔗糖，10％甘油)洗涤一次，6000g，4℃离心20min，收集菌体；
(6)用冰冷的200ml的洗液ii(0.5m蔗糖，10％甘油，50mmedta)重悬菌体，冰上静置15min，6000g，4℃离心20min，收集菌体；
(7)再用冰冷的洗液i(0.5m蔗糖，10％甘油)100ml重悬菌体，6500g，4℃离心20min，收集菌体，得乳酸乳球菌nz3900感受态；
(8)用4ml冰冷的洗液i(0.5m蔗糖，10％甘油)悬浮菌体，分装入预先冰浴的1.5mlep管中，每管100μl储存于-80℃。
2.5连接产物电转化入乳酸乳球菌nz3900
(1)从-80℃冰箱中取出感受态细胞(nz3900)，置于冰上解冻，吸取10μl连接产物加入感受态细胞，混匀后，置于冰上5min；
(2)将混合液加入冰冷的2mm电击转化杯中，轻轻敲击电击杯以确保混合液位于电击杯底部并没有气泡；
(3)用滤纸擦干电击杯外的冷凝水，放入电击仪；
(4)调节电击仪，使脉冲为25μf、电压2000v、电阻200ω，进行电击；
(5)电击结束后，迅速加入1ml冰冷的gm17-mc恢复培养基，混匀后转入1.5ml的ep管中冰浴5min，30℃静止培养1h；
(6)吸取100μl恢复培养的菌液接种于elliker选择培养基，30℃静止培养2d，挑取黄色菌落进行鉴定。
2.6阳性克隆子pnz8149-cfra/nz3900的筛选鉴定
(1)从过夜培养的ellike选择培养基上挑取黄色阳性菌落，加入5mlgm17液体培养基，30℃静止培养；进行菌液pcr鉴定，pcr步骤同前。
(2)根据qiagen公司qiaprepspinminiprepkit试剂盒说明书提取质粒，具体步骤同前，将上述所提取的质粒，用ncoi、saci双酶切，酶切体系及条件同前。
(3)将菌液pcr及双酶切鉴定均为阳性的克隆，送生工生物工程股份有限公司测序。序列正确的质粒命名为pnz8149-la2，相应的重组乳酸乳球菌分别命名为pnz8149-la2/nz3900。
结果如下：
用puc-57-la2dna为模板，pcr扩增la2基因，对扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分析的结果显示，扩增基因片段长度与预期长度(1702bp)相符。
2.阳性转化菌的筛选
3.阳性转化菌的鉴定
挑取黄色菌落接种至gm17液体培养基中，培养12h，用质粒提取试剂盒从菌液中提取质粒，以提取的质粒为模板，用前述la2基因扩增引物进行pcr鉴定，结果显示，pcr扩增产物的长度与预期相符，具体如图4所示，其中，1为maker，2-5为疑似阳性克隆菌，6为阳性对照，7为阴性对照。将pcr鉴定为阳性的质粒ncoi及saci双酶切，双酶切片段长度分别为2.548kb和1.7kb，均与预期长度一致。
4.阳性转化菌的测序鉴定
(2)取2ml菌液加入到50mlgm17液体培养基，于30℃、5％co2培养箱，静置培养至菌液od至0.3-0.5时，加入诱导剂nisin(sigma公司)至终浓度分别为0.5ng/ml，1ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml，40ng/ml，60ng/ml，诱导培养4h，同时取诱导前作为阴性对照。
(2)取2ml菌液加入到50mlgm17液体培养基，于30℃、5％co2培养箱，静置培养至菌液od至0.3-0.5时，加入诱导剂nisin(sigma公司)至终浓度为20ng/ml，分别诱导培养1h，2h，3h，4h，5h，同时取诱导前作为阴性对照。
3.3菌体总蛋白样品的收集
(1)诱导4h后，取30ml菌液于4℃、8000r/min离心5min，弃上清，留取菌体沉淀；
(2)加pbs30ml悬浮菌体，8000r/min、4℃离心5min，弃上清；
(3)加pbs3ml重悬菌体，超声，工作2s，停3s，共30min。
(4)吸取80μl超声后菌液，加入20μl5×sdsloadingbuffer，混匀，
煮沸10min，于-20℃贮存备用。
3.4重组菌株诱导产物的sds-page分析
(1)制胶：sds-page凝胶配制方法如表1所示：
表1sds-page凝胶配制方法
12％的分离胶配制：将各成分加入后迅速混合，加入制胶板中，上面加纯化水。然后，再配制5％浓缩胶：将表中相关各成分加入后迅速混合，加入制胶板的分离胶的上面(先将分离胶上面的纯化水倒干净)，灌满后插入加样梳。待浓缩胶凝固后，取下梳子。
(2)取煮好蛋白样品20μl上样，以蛋白质标准分子量为参考，在12％sds-page上进行电泳分析。待积层胶凝固后，取下梳子；将凝胶固定于电泳装置上，加入足够量的tris-甘氨酸电泳缓冲液，在加样孔中分别加入各样品；电泳电压120v，电流在20-40ma范围内，电泳1h，至溴酚蓝泳出胶底面，终止电泳；
(3)电泳结束后，小心取下胶，放入考马斯亮蓝染液染色30min，染液漫过胶即可，置于摇床上，转速约为45r/min。
(5)将脱色后的胶进行扫描，留照片。
结果如下：
1.最佳诱导剂浓度筛选
操作步骤如下：
2.转膜：sds-page电泳结束后，将凝胶切成所需大小，把硝酸纤维素膜(北京索莱宝科技有限公司)和厚滤纸剪成与凝胶相同大小，将硝酸纤维素膜在甲醇中浸润15s；在bio-rad电转仪中依次叠放厚滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜和厚滤纸；25v，转膜30min。
3.封闭：转膜后，用pbs漂洗硝酸纤维素膜一次，然后将硝酸纤维素膜置于封闭液(含5％脱脂奶粉的pbs)中，室温缓慢摇动封闭2h，封闭后，用pbs洗涤3次，每次漂洗5min。
4.一抗反应：取针对la2的单克隆抗体(可采用常规方法制备获得)用封闭液1:2000稀释，硝酸纤维素膜置于稀释后的la2单克隆抗体，37℃孵育lh。用tbst漂洗3次，每次持续5min。
5.二抗反应：在硝酸纤维素膜上加入用含1％g/l脱脂奶粉的pbs稀释过的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠igg，37℃lh，用tbst溶液漂洗3次，每次5min。
6.显色：将硝酸纤维素膜放入平皿中，用dba显色试剂盒(北京康为世纪科技有限公司)进行显色，参照产品说明书，步骤为：取lml反应液入到1.5ml离心管中，再向离心管中加入50μl试剂a，b，c，混匀后，将混合液滴加在硝酸纤维素膜上，显色l～5min，显色后把膜放入到去离子水中浸泡，终止反应。
4.2结果如下：
1.1疫苗的制备
全菌灭活疫苗制备：分别将a、b、c型副鸡禽杆菌hp8株、bj株和668株菌经纯培养后，挑取单个菌落8～10个，涂于tsa平板上(含10％灭活牛血清)。37℃培养16h～18h后，用灭菌的0.01mol/lpbs将平板上的菌苔洗下，稀释至7.5×109cfu/ml，用甲醛灭活(3‰)4h～48h，然后等体积混合。混合菌液与10号工业白油(杭州炼油厂)佐剂按1：1体积混合，胶体磨乳化，分装备用。
1.2免疫方法
42日龄spf试验鸡90只，分为v-la2疫苗组、常规三价灭活疫苗组和pbs对照组。重组v-la2疫苗组、常规三价灭活疫苗组和pbs对照组各30只。疫苗组试验鸡采用胸部肌肉注射的途径，0.5ml/只，分别用v-la2疫苗组和常规三价灭活疫苗接种免疫；对照组试验鸡接种pbs，0.5ml/只。4周后相同剂量、相同途径加强免疫。
1.3免疫鸡攻毒试验
对加强免疫4周后的试验鸡全部进行攻毒试验。各试验组内再分别用a型(hp8株)，b型(bj株)和c型(668株)apg进行攻毒，每组10只，眶下窦接种，剂量依次是a型hp8株5×105cfu，b型bj株2×105cfu，c型668株5×105cfu。连续观察一周，记录试验鸡的临床发病情况，包括流鼻涕，眼睑肿，溢泪等。评价重组亚单位疫苗的免疫保护力，结果参见表2。
表2不同疫苗免疫鸡对apg菌株攻毒的保护效果
注：攻毒剂量a型hp8株5×105cfu，b型bj株2×105cfu，c型668株5×105cfu。
*表示重组活疫苗免疫组(v-la2)获得免疫保护的试验鸡数与非免疫空白对照组比较，差异显著。
表2列出了a型hp8株、b型bj株和c型668株的攻毒实验结果。实验时，采用本发明的乳酸乳球菌重组菌制备的疫苗(v-la2)免疫试验鸡，2次免疫后用a，b，c三个血清型的apg强毒攻击，非免疫对照组所有试验鸡陆续发病。乳酸乳球菌重组疫苗免疫组攻毒后只有1只试验鸡表现出鼻炎症状，保护率为90％～100％；全菌三价灭活疫苗免疫组在攻毒后3天内各有2-3只鸡出现临床症状，保护率为70％-80％；而非免疫对照组所有试验鸡都表现出严重的鼻炎症状。
此外，重组乳酸乳球菌活疫苗(v-la2)的保护率优于全菌三价灭活疫苗的保护效果，与非免疫组相比，有极显著差异。乳酸乳球菌遗传背景和调控机制相对清楚，且食品级的诱导物和宿主菌，不含任何抗生素抗性基因；作为革兰氏阳性菌，其内毒素含量较革兰氏阴性细菌低很多。在安全性方面的优势十分突出。乳酸乳球菌严谨性高，本底表达水平低，诱导效率高，表达产量高，少内毒素；从制备成本上说，培养基便宜，容易纯化等特点，也低于常规灭活菌苗。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
[0001]序列表
[0002]<110>北京市农林科学院
[0003]<120>一种副鸡禽杆菌的保护性抗原、及其表达和应用
[0004]<160>4
[0005]<170>siposequencelisting1.0
[0006]<210>1
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[0009]<213>保护性抗原蛋白(protectiveantigent)
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