李芳宇，齐 滨，边 帅，赵 月，卢姝言，迟 迅，王佳雯*
1长春中医药大学药学院；2长春中医药大学人参科学研究院；3长春中医药大学科研处，长春 130117
自噬是一种维持机体稳态平衡的过程,能吞噬自身细胞质蛋白或细胞器并使其包被进入囊泡，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体,降解其所包裹的内容物,藉此实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新[2,3]。自噬在巨噬细胞吞噬、抗原呈递、调节免疫应答和炎性反应过程中起重要作用[4]。巨噬细胞自噬功能下降会影响其吞噬功能。人参具有增强免疫力的作用，在特异性抗体形成、淋巴细胞增殖及巨噬细胞吞噬能力增强等多方面均有所体现[5]。故本文选用人参根提取物作用于巨噬细胞RAW264.7，探究其对巨噬细胞的自噬水平、增殖能力及吞噬能力影响，为人参根提取物的深入研究提供理论基础。
Infinite 200 Pro酶标仪(瑞士，TECAN公司)；111型二氧化碳培养箱(美国，Thermo公司)；荧光显微镜IX73(日本，Lympus公司)；1645050型蛋白质凝胶电泳仪(美国，Bio-Rad公司)；iBright智能成像系统 FL1000(中国，Invitrogen公司)。
1.3.1 人参根提取物制备
精密称取人参50 g，粉碎，过筛(80目)，料液比1∶10，40 ℃水浴超声提取2 h，提取液离心过滤，超滤浓缩；残渣加水料液比1∶10，升温至80 ℃提取1.5 h，提取液超滤浓缩，浓缩液分别冻干，备用。人参根提取物收率为21.58%。
1.3.2 细胞培养
将巨噬细胞RAW264.7于高糖DMEM完全培养液中(含有10% FBS、1%的链霉素和青霉素)，置于37 ℃、含5% CO2的培养箱内培养。选择对数生长期细胞用于实验。
1.3.3 CCK8细胞增殖实验
前期经过设置一系列浓度梯度确定了人参根提取物在0～500 μg/mL浓度范围内对巨噬细胞RAW264.7无毒性，且能够通过浓度梯度依赖性的方式提高细胞活性(数据未显示)。因此本实验选用32、125、500 μg/mL三个浓度作为低中高剂量进行研究。
选取对数生长期细胞，按1×105个/mL，100 μL/孔接种于96孔板中，于37 ℃、含5% CO2的培养箱内培养24 h后弃去培养液，加入质量浓度分别为(32、125、500 μg/mL)的人参根提取物，同时设置空白对照组(完全培养液、细胞)和1 μg/mL的LPS阳性对照组；培养24 h后每孔加入10 μL的CCK8于培养箱中继续孵育40 min，用酶标仪在490 nm出测定吸光值，实验重复3次，计算细胞的相对存活率。
相对细胞存活率=[(实验组孔吸光值-空白组孔吸光值)/(对照组孔吸光值-空白组孔吸光值)]
×100%
1.3.4 中性红吞噬实验
将密度为1×105个/mL细胞接种于96孔板中，每孔100 μL于CO2的培养箱内培养24 h后弃去培养液，加入质量浓度分别为(32、125、500 μg/mL)的人参根提取物，同时设置空白对照组(完全培养液、细胞)和1 μg/mL的LPS阳性对照组；培养24 h后，吸出上清液，磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)洗涤2次，每孔加入培养液200 μL和中性红染液20 μL，于培养箱内继续孵育3 h；弃除上清液，再用PBS洗涤2次，每孔加入200 μL裂解液，室温摇床裂解10 min，用酶标仪在540 nm波长处测定A值，实验重复3次，按公式计算吞噬指数。
吞噬指数=实验组A540nm/空白对照组A540nm
1.3.5 AO染色实验
将密度为1×105个/mL细胞接种于6孔板中，每孔2 mL于CO2的培养箱内培养24 h后弃去培养液，加入质量浓度分别为(32、125、500 μg/mL)的人参根提取物，同时设置空白对照组(完全培养液、细胞)和500 nM的rapamycin阳性对照组；培养24 h后，吸出上清液，PBS缓冲溶液洗3次，4%多聚甲醛室温固定10 min，弃上清，PBS缓冲溶液洗3次，加入终浓度为15 μg/mL的AO，室温避光孵育15 min，弃上清，PBS缓冲溶液洗3次，实验重复3次，在荧光显微镜下观察细胞的形态并照相。
1.3.6 Western blot检测RAW264.7 细胞因子的蛋白表达
将密度为1×105个/mL细胞接种于6孔板中，每孔2 mL于CO2的培养箱内培养24 h后弃去培养液，加入质量浓度分别为(32、125、500 μg/mL)的人参根提取物，同时设置空白对照组(完全培养液、细胞)，培养24 h后，收集细胞，离心(1 000 rpm，5 min)，弃上清，PBS缓冲溶液洗3次，加入细胞裂解液。使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测蛋白浓度。电泳分离，转膜(NC膜)、封闭30 min后，一抗孵育4 ℃过夜，回收一抗，PBST洗3次，二抗室温孵育1 h，实验重复3次，进行显色观察条带。
1.3.7 自噬对细胞增殖及吞噬能力影响检测实验
将密度为1×105个/mL细胞接种于96孔板中，每孔100 μL于CO2的培养箱内培养24 h后弃去培养液，设置空白对照组(完全培养液、细胞)、单独给药组125 μg/mL人参根提取物、500 nM的rapamycin和125 μg/mL人参根提取物共同给药组、50 μM的CQ和125 μg/mL人参根提取物共同给药组；500 nM rapamycin组、50 μM CQ组，培养24 h后，分别按照“1.3.3”与“1.3.4”实验方法进行检测。
1.3.8 统计学方法
由图1可知，与对照组比较，人参根提取物浓度为(32、125、500 μg/mL)和LPS阳性组均能提高巨噬细胞RAW264.7的增殖率(P<0.05，P<0.01)，由此可见人参根提取物可直接刺激巨噬细胞RAW264.7增殖。
图2 人参根提取物对巨噬细胞RAW264.7吞噬活性的影响Fig.2 Effect of ginseng root extract on macrophage
由图2可知，与空白对照组相比，当人参根提取物浓度为32 μg/mL时，人参根提取物对巨噬细胞RAW264.7吞噬活性的影响无统计学意义。当人参根提取物浓度为125、500 μg/mL时则可提高巨噬细胞的吞噬活性，且与对照组相比具有显著性差异(P<0.01)，该结果表明，一定浓度的人参根提取物可提高巨噬细胞RAW264.7吞噬能力。
AO染色被认为是标记自噬溶酶体的特异性方法，当自噬水平较低时，主要观察到绿色荧光；当自噬水平升高时，红色荧光将增强。由图3可知，与空白对照相比，随着人参根提取物浓度的增加，合并后的荧光颜色由绿色逐渐过渡到黄色，说明自噬水平升高。
图3 人参根提取物对巨噬细胞RAW264.7中自噬体数量的影响(×20)Fig.3 Effect of ginseng root extract on the number of autophagosomes in RAW264.7(×20)
由图4可知，与空白对照组相比，125、500 μg/mL人参根提取物组巨噬细胞RAW264.7中ATG7和p-ULK1的表达提高、LC3B I向LC3B II的转化增加，进一步说明自噬被诱导。同时p-AMPK蛋白表达明显升高，而p-mTOR和p-AKT表达降低，具有统计学差异(P<0.05，P<0.01)。说明人参根提取物通过促进自噬相关蛋白的增加并激活AMPK /mTOR和AKT/mTOR信号通路，诱导巨噬细胞RAW264.7发生自噬。
图4 人参根提取物对巨噬细胞RAW264.7中自噬相关蛋白表达的影响Fig.4 Effect of ginseng root extract on autophagy-related protein expression in macrophage
由图5、6可知，与空白对照组相比，单独给药组(人参根提取物浓度为125 μg/mL)和单独加入自噬诱导剂(rapamycin)组可增强巨噬细胞RAW264.7增殖以及吞噬能力增强(P<0.01)，单独加入自噬抑制剂(CQ)组则降低可巨噬细胞RAW264.7增殖以及吞噬能力(P<0.05)；与单独给药组相比，rapamycin与人参根提取物共处理可增强巨噬细胞RAW264.7增殖以及吞噬能力(P<0.01)；与单独给药组相比，人参根提取物与自噬抑制剂(CQ)共处理后，巨噬细胞RAW264.7的增殖以及吞噬能力明显降低(P<0.05，P<0.01)。由此可见，人参根提取物可能通过增强巨噬细胞RAW264.7的自噬水平，提高细胞的增殖以及吞噬能力。
图5 自噬抑制剂中和了人参根提取物对巨噬细胞RAW264.7增殖的影响Fig.5 Effect of ginseng root extract on RAW264.7 proliferation of macrophages neutralized by 注：F：125 μg/mL人参根提取物+rapamycin；G：125 μg/mL人参根提取物+CQ；H：Rapamycin；I：CQ，下同。Note:F:125 μg/mL ginseng root extract +rapamycin;G:125 μg/mL ginseng root extract +CQ;H:Rapamycin;I:CQ,the same below.
图6 自噬抑制剂中和了人参根提取物对巨噬细胞RAW264.7吞噬活性的增强作用Fig.6 Autophagy inhibitors neutralize ginseng root extract against macrophage RAW264.7 enhancement
增殖是免疫细胞分化成多种功能表型并在免疫应答中发挥相应作用的前提与基础，吞噬作用则是巨噬细胞等吞噬细胞清除外源性病原微生物和内源性衰老和死亡细胞的重要手段[6]。在本研究中，一定质量浓度的人参根提取物能够显著促进巨噬细胞增殖，增强其吞噬能力，表明人参根提取物能够通过促进巨噬细胞的增殖，以及提高巨噬细胞的吞噬能力，从而达到免疫调节作用。
自噬是一种保守的细胞降解途径。自噬利用溶酶体降解自身受损细胞器及大分子物质,其产生的氨基酸和小分子物质被重新利用,从而实现胞内物质循环和内环境平衡[7]。自噬形成时，胞浆型LC3会酶解一小段多肽形成LC3-Ⅰ，LC3-Ⅰ与PE结合形成(自噬体)膜型(即LC3-Ⅱ)[8]，因此，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值的大小可估计自噬水平的高低，当哺乳动物细胞发生自噬时，细胞内LC3的含量及LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化明显增强。自噬相关蛋白7(autophagy related protein7，Atg7)在自噬过程中可以促进自噬性溶酶体的形成和受损线粒体的分解[9]。
AMPK /mTOR与Akt/mTOR是两条经典的自噬信号通路[10,11]。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是一种丝/苏氨酸激酶，其活化(磷酸化)后可抑制mTOR活性，提高细胞自噬水平[12]。蛋白激酶B(Akt或称PKB)同样也是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，其可协同磷脂酰肌醇依赖性蛋白激酶1/2促进三磷酸磷脂酰肌醇与其自身结合，Akt由胞浆转移至质膜并发生活化(磷酸化)，Akt活化后可激活下游蛋白mTOR(使其磷酸化)，从而抑制自噬的进程[11]。
研究结果显示，巨噬细胞RAW264.7中Atg7、LC3蛋白表达量增加，p-AKT、p-mTOR表达减少，AMPK磷酸化水平增加，与对照组比较差异均具有统计学意义。说明人参根提取物通过多种途径参与调解巨噬细胞RAW264.7的自噬反应。 自噬在巨噬细胞行使功能过程中具有重要作用。通过自噬调节剂调节自噬水平，可以增强或中和人参根提取物对巨噬细胞RAW264.7功能的影响。
综上所述，人参根提取物能够促进巨噬细胞RAW264.7增殖，增强其吞噬功能，通过AMPK/mTOR和AKT/mTOR信号通路，提高巨噬细胞RAW264.7的自噬水平，两者具有相关性。本研究为人参根提取物在细胞自噬、免疫调节中的应用提供了一定的理论依据，但其作用的分子机制仍有待进行深入研究。