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PART2 抗体孵育及检测（1）淬灭：如果使用基于酶或者生物素的检测系统，样本中内源性酶的活性（过氧化物酶/碱性磷酸酶）或者内源性生物素会对检测产生非特异性干扰，因此在血清封闭之前需要先对样品进行淬灭。根据使用的二抗偶联标记不同，使用对应的内源性封闭液进行淬灭。小技巧：使用免疫组化笔在样本周围画圈建立疏水隔离区，可以避免样品间的交叉染色和节约血清和抗体的用量。
（2）封闭：使用血清对样品中非特异性结合位点进行封闭。一般建议在TBST/PBST中加入5%的山羊血清作为封闭液，也可使用商品化的非动物源的封闭液#15019。需要注意如果使用酪蛋白封闭液（例如牛奶），可能会影响磷酸化抗体的识别。操作步骤：每张切片加100μL（用量以浸没样本区域为准，可灵活调节）5%山羊血清封闭液，室温孵育30min。
（3）孵育一抗：抗体孵育可以选择直标一抗的方式或者无标记的一抗再偶联HRP标记的二抗。间接检测的方式可以进行信号放大，灵敏度更高，是更为常规的检测方式。一抗用于与样品中的靶标抗原进行特异性结合。在选择IHC一抗的时候应注意以下几点：1、一抗的反应种属：一抗的反应种属应与样品的种属一致，并且一抗的宿主来源不同于样品种属。例如：如果样品是小鼠的肿瘤，应选择针对于小鼠的抗体。
2、一抗的特异性：抗体的特异性不好，容易引起非特异性染色，单克隆抗体的特异性优于多克隆抗体。标记mAb的一般是指单克隆抗体；
（5）底物检测：IHC通过酶和底物反应在抗体结合处显色以检测抗原表达。显色检测中需要根据抗体上的偶联标记来选择对应的底物，常见的偶联标记有HRP和AP。二抗上带有HRP标记时，一般选择DAB作为底物进行检测。操作步骤：配制即用型DAB工作液，滴加新鲜配制的DAB工作液到切片上，完全覆盖标本。通常显色1-10min，DAB显色时间需要镜下控制，选择最佳显色时间，做好防护。自来水冲洗终止DAB显色反应。
（6）苏木素复染：苏木素经氧化后生成苏木精，是一种碱性染料，组织学中用于细胞核的染色，染色后的细胞核呈鲜明的蓝色或蓝紫色，可以更方便的查看细胞形态。操作步骤：滴加适量苏木素以覆盖整个组织，复染 30sec~3min。用自来水完全冲洗掉复染液。酸酒精（在100ml 70%乙醇中加入1ml盐酸）分化3-5sec后水洗30sec，终止反应。去离子水冲洗切片 3~5min，使胞核返蓝。
PART 3 封片和观察（1）脱水：80%、95%、100%、100%酒精，每步5min、二甲苯5min、重复两次。（2）中性树脂封片：在玻片上滴加一滴中性树脂，从侧边缓缓盖上盖玻片，动作应尽量缓慢，以防止产生气泡。
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IHC常见问题【1.高背景】
1.封闭问题
封闭不好是最常见的导致高背景的原因，切记要注意以下几个方面：首先封闭液的浓度我们可以适当增加，并延长封闭时间，来达到更好的封闭效果；其次容易忽略的是我们通常采用稀释的动物血清作为封闭液，这时就要注意血清的种属，最好使用与二抗同种属来源，切记不可使用与一抗同种属来源。
2.抗体浓度
有时一抗的浓度太高会导致较高的背景，因此我们可以在原有一抗浓度的基础上提高稀释度，并减少抗体孵育的时间，来达到降低背景的目的。当然这也和抗体的效价有关，记得认真查看抗体厂家的建议稀释比。
3.内源性物质影响
【2.信号弱】
1.抗体影响
厂家在生产抗体的时候会做抗体应用检测，记得查看自己的抗体是否能运用于IHC；其次，抗体的效价较弱，这是我们可以通过提高抗体浓度来增强结果的信号；最后，大家切记在保存荧光二抗的时候要避光。
2.样本保存
应选择新鲜组织进行实验，样品取出后应尽快放入固定液中。固定液现用现配。
3. 样本个体差异从Uniprot或者Atlas网站上查看蛋白的定位，修饰等信息，并查询蛋白在不同种属和组织间的表达情况。或者可以先使用其他方法（如WB，Flow等）对样品先进行筛选或设立阳性对照。
【3.样本形态不好】
1.掉片问题
2.固定问题
3.抗原修复问题
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