开放科学(资源服务)标识码(OSID)
1.1.1 实验动物 无特定病原体(SPF)级雄性SD大鼠48只,6~8周龄,体质量(200±20)g。购自新疆医科大学动物实验中心[生产许可证编号:SYXK(新)2011-010101],实验大鼠在石河子大学第一附属医院动物中心进行饲养[动物许可证编号:SYXK(新)2011-0002],SPF级饲养环境下由专人添加食物与水,相对温度为20~25 ℃,相对湿度为50%~70%,室内通风良好,进食、饮水及笼内活动不设限。本实验的动物实验方案均得到石河子大学动物保护与使用委员会的批准(批号:A2018-018-01)。
1.1.2 药物与试剂 白藜芦醇购自上海麦克林生物科技有限公司,批号:817263,含量≥99%;Ex527(SIRT1抑制剂)购自上海罗恩试剂公司,批号:312666,含量≥98%;SIRT1(货号:ab32441)、FTH-1(货号:ab183781)购自美国Abcam公司;GPX4(货号:T56959)购自上海Abmart公司;RIPA组织裂解液(货号:R0010)、Alexa Fluor 594标记的羊抗兔IgG荧光二抗(货号:K1034G-AF594)购自北京索莱宝生物技术公司;DHE染色试剂盒(货号:D1008)购自苏州宇恒生物技术公司;辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠二抗(货号:GB23301)、山羊抗兔二抗(货号:GB23303)、抗β-actin抗体(货号:GB11001)均购自武汉赛维尔生物技术有限公司;高敏型ECL化学发光检测试剂盒(货号:E412-01/02)均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司;乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒(货号:A0202-2)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase-myocardial band,CK-MB)试剂盒(货号:H197-1~2)、还原型谷胱甘肽(GSH)测定试剂盒(货号:A006-2-1)、丙二醛(MDA)测定试剂盒(货号:A003-1~2)购自南京建成生物工程研究所;铁离子比色法检测试剂盒(货号:E1042)购自北京普利莱生物公司。
1.1.3 仪器 Z323K低温离心机(德国HERMILE公司),多功能酶标仪Elx-800(美国Bio-Bad公司),石蜡包埋机、轮转式切片机(德国LEICA公司),光学显微镜(日本OPAGmpus公司),全自动化学发光成像仪5200(中国上海天能公司)。
1.2.3 心肌组织苏木精-伊红(HE)染色 手术取出心脏组织后洗净残余血液,置于4%多聚甲醛缓冲液中固定保存48 h后行石蜡包埋,使用切片机将组织切片厚度5 μm,60 ℃烤片30 min进行脱蜡,水洗后行HE染色,梯度乙醇脱水,透明,滴加适量中性树胶后加盖玻片封片,待切片干燥后光学显微镜下观察并拍照保存。
1.2.4 透射电镜观察 透射电子显微镜采用武汉赛维尔生物技术公司的标准程序进行。大鼠处死后3 min内取样,心脏组织取下后洗净切片面积2 mm×2 mm,投入电镜固定液内室温固定2 h,再转移至4 ℃冷藏保存运输。之后使用1%琼脂糖包埋细胞,脱水,用超微切片机切割成超薄切片(厚度70 nm)。切片用乙醇配制的醋酸铀染色15 min,然后用柠檬酸铅染色15 min。使用透射电子显微镜(HT7700,HITACHI)拍摄图像,每组至少拍摄图像5张。
1.2.5 生化指标检测 取大鼠腹主动脉血3 mL离心血清,分别检测LDH和CK-MB的变化水平。通过研磨取左心室心肌组织匀浆上清液检测GSH和MDA的变化水平。操作步骤均按照对应试剂盒说明书方法操作。
1.2.6 心脏组织铁离子浓度检测 采用亚铁嗪比色法定量检测铁离子浓度。心脏组织称质量后使用RIPA组织裂解液冰上裂解30 min。设置空白对照管、标准品管和样品管,加入铁离子检测剂30 μL,混匀,室温孵育30 min。样品在波长 550 nm 处读取吸光度(A值),以标准曲线取值。
1.2.7 DHE染色检测组织活性氧自由基(realtive axygen species,ROS) 采用新鲜组织冰冻切片进行DHE染色。取下心脏后,使用含乙醇-干冰的OCT化合物包埋心脏组织,待冰冻切片机至最佳切割温度,将其切成切片厚度5 μm,并置于载玻片上,储存在-80 ℃冰箱。在每个组织切片上滴加DHE(10 mol·L-1),37 ℃避光湿盒中30 min,荧光显微镜观察和拍摄红色发射图像,ROS阳性细胞在整个核区被染成红色(激发波长为490 nm,发射波长为610 nm)。
1.2.8 Western blotting检测心肌SIRT1、GPX4、FTH-1蛋白表达 心肌组织冰上研磨至匀浆,加入RIPA组织裂解液裂解30 min,12 000 r·min-1离心(离心半径6 cm),取上清液,测定蛋白浓度。蛋白加上样缓冲液后煮沸上样,进行凝胶电泳,使用湿转法转膜后,BSA封闭液封闭2 h,使用SIRT1、GPX4、FTH-1(1:1000)4 ℃孵育过夜,TBST洗3次,每次5 min,对应二抗室温孵育1 h,TBST洗3次,每次5 min,滴加ECL发光液与膜作用后进行显影。
见图1。大鼠心肌HE结果显示,24 h后所有假手术组大鼠心肌细胞排列整齐有序,未见明显异常。模型对照组心肌细胞水肿、变性,部分横纹肌模糊(黑色箭头所示),间质纤维结构紊乱(红色箭头所示),炎性细胞浸润(绿色箭头所示)。与模型对照组比较,白藜芦醇组偶见炎症细胞浸润,病理损伤程度明显减轻。而Ex527组损伤程度较白藜芦醇组明显加重。
见图3。与假手术组比较,模型对照组大鼠血清中LDH和CK-MB均显著升高(P<0.01),表明模型对照组大鼠心肌功能受损。造模后使用白藜芦醇腹腔注射,该组大鼠LDH和CK-MB均显著降低(P<0.01)。与白藜芦醇组比较,Ex527组LDH和CK-MB均显著升高(P<0.01)。
见图4。与假手术组比较,模型对照组大鼠GSH含量显著降低,MDA含量显著升高(P<0.01)。与模型组比较,白藜芦醇组大鼠的GSH含量显著升高,MDA含量显著降低(P<0.01)。与白藜芦醇组比较,Ex527组GSH水平明显降低,而MDA明显升高(P<0.05)。
见图5。与假手术组比较,模型对照组大鼠心肌细胞中铁离子含量显著升高(P<0.01)。在使用白藜芦醇干预后,该组大鼠铁离子含量显著降低(P<0.01)。与白藜芦醇组比较,Ex527组铁离子含量明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。
见图6。与假手术组比较,模型对照组大鼠心肌ROS表达显著升高(P<0.01)。与模型对照组比较,白藜芦醇组ROS表达受到抑制(P<0.01)。在使用Ex527之后,ROS表达水平明显升高(P<0.05)。
见图7。与假手术组比较,模型对照组大鼠心肌中SIRT1、GPX4、FTH-1显著降低(P<0.05)。与模型对照组比较,白藜芦醇给药组能显著提高SIRT1、GPX4、FTH-1蛋白表达水平(P<0.05)。在使用Ex527之后,SIRT1、GPX4、FTH-1蛋白表达水平明显减少(均P<0.05)。
综上所述,白藜芦醇可以通过调节SIRT1/GPX4信号通路抑制心肌铁死亡,改善CLP诱导的SIC,其分子机制可能与上调GPX4蛋白表达、减少ROS积累,减轻线粒体损伤有关。本研究也存在一定局限性,第一,上述讨论机制可能是白藜芦醇对大鼠SIC的治疗作用的一方面,与其他细胞死亡死亡形式,如自噬、凋亡、焦亡等协同作用值得深入研究;第二,未使用细胞或者基因敲减等方法进一步验证加强证据链,是否存在其他的中间调控靶点参与SIRT1对铁死亡的调控也需进一步阐明。
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