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1、原位杂交操作流程1、使用地高辛标记的核酸探针进行石蜡切片的RN顺位杂交第一天1)二甲苯于37c脱蜡2次，每次15分钟；2)无水乙醇浸泡2次，每次3分钟；3)95%乙醇浸泡2次，每次3分钟；4)PBS清洗3分钟；5)2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；6)PBS清洗10分钟；7)加入胃蛋白酶25ul/ml,37c孵育15分钟；8)PBS清洗2次，每次3分钟；9)0.2N的HCl孵育30分钟；10) PBS清洗2次，每次3分钟；11) 0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；12) PBS清洗2次，每次5分钟；13)预杂交缓冲液孵育30分钟；14)准备核酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释
2、探针，85c加热5分钟，置于冰块中10分钟；15)杂交；第二天16)将玻片置于SSC中2次，每次5分钟以去除封片；17) PBS清洗3分钟；18) RNABA溶液中(或0.1-1ng/mlPBS中),37c孵育30分钟；19) PBS清洗5分钟；20)室温，2XSSC清洗10分钟；21) 37C,1XSSC清洗10分钟；22) 37C,0.5XSSC清洗10分钟；23)缓冲液A孵育10分钟；24)缓冲液A(1%E常绵羊血清和0.03%三重氢核X-100)孵育30分钟；25)加入抗地高辛抗体(1/200的上述缓冲液，来自BoehringerMannheim),37c孵育3小时；26)缓冲液A清洗
3、2次，每次10分钟；27)缓冲液B清洗2次，每次5分钟；28)制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可延长到16小时;29)停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗；30)固红，脱水以及封片进行核的复染。2、使用地高辛标记的寡核昔酸探针进行石蜡切片的原位DN跺交第一天1)二甲苯于37c脱蜡2次，每次15分钟；2)无水乙醇浸泡2次，每次5分钟；3)95%乙醇浸泡2次，每次5分钟；4)PBS清洗5分钟；5)2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；6)PBS清洗5分钟；7)加入胃蛋白酶25ul/ml,37c孵育10分钟；8)PBS清洗2次，每次5分钟；9)0.
4、2N的HCl孵育30分钟；10) PBS清洗2次，每次5分钟；11) 0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；12) PBS清洗5分钟；13）预杂交缓冲液孵育30分钟；14）准备寡核昔酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针；15）杂交；第二天16）将玻片置于SSC中以去除封片；17）室温，2XSSC清洗10分钟；18） 37C,1XSSC清洗10分钟；19） 37C,0.5XSSC清洗10分钟；20）缓冲液A孵育10分钟；21）缓冲液A孵育30分钟；22）加入抗地高辛抗体37c孵育3小时；23）缓冲液A清洗2次，每次5分钟；24）缓冲液B清洗2次，每次5分钟；25）制成NBT/BCI
5、P暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可长到16小时;26）停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗；27）固红，脱水以及封片进行核的复染。FISH步骤1、脱蜡：1）二甲苯脱蜡3次，每次5min；2）100%酒精两次，每次2min；3）移出酒精，斜置切片，标记末段向下，空气干燥。2、蛋白酶处理：1）每个染色缸40ml蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2XSSC40ml倒人Facal管，在水浴槽中预热。将消化酶液加入管内，摇动直到酶溶解。2） 37c水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。37c孵育20min。3） XSSC在室温下漂洗切片3次，每次1min。4）梯度酒精脱水（
6、-20C预冷）。3、变性：1）每一个立式染色缸配制40ml变性溶液；2） 78c水浴槽中平衡预热混合液染色缸；3） 78c孵育8min；4）即移入-20C预冷70%酒精的染色缸内2min,再依次移入80%、90%和100%的-20C预冷酒精内，每缸2min；5）空气干燥。4、杂交：1）准备探针；2）取一个较大的湿盒，交叉放置切片；3）滴10M探针在切片的组织上，加盖玻片；4）盖上湿盒盖，37c孵育12h16h。杂交后的水洗：5）镣子小心去除盖玻片；6） 43c预热杂交后水洗溶液40ml水洗切片15min;7） 2XSSC（37C）洗两次，每次10min；8）切片放人染色缸的1XPBS内待检测，
7、勿使切片干燥。检测：9)从1XPBS中取出切片，除去过多的水分，避免标本干燥。把切片放入湿盒内，同时处理4张切片。10)每张切片使用30M卜60M罗丹明抗-地高辛抗体或FITC卵白素，室温下孵育20min；11)去掉塑料盖膜，把切片放入含1XPBS的染色缸。1XPBS室温下洗3次，每次2min。扩增：12)从1XPBS中取出切片，斜置切片使液体排出；13)每张切片滴30M卜60M抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min；14)去掉塑料盖膜，把切片放人含1XPBS的染色缸。1XPBS室温下洗3次，每次2min；15)从1XPBS中取出切片，斜置切片使液体排出；16)每张切片滴30M卜60M
8、抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min；17) 1XPBS室温下洗3次，每次2min。5、细胞核染色：1)张切片加10M卜201DAPI,覆盖盖玻片并在室温下孵育25ml;2)尽可能快的在荧光显微镜下观察或封闭盒内保存在-20C冰箱。切片在染色之后1h内可以在显微镜下观察。地高辛标记寡核甘酸探针1 .组织处理(1)冷冻切片：厚1020Mm,贴于事先经清洁处理及涂有粘W剂的切片上。切片保存于-80C,在应用于杂交实验前，使迅速回升到室温，干燥，固定于3修聚甲醛-PBS溶液中，pH7.4oPBSg洗5minX3,孵育在2xSSc10min。(2)石蜡包埋切片：浸入二甲苯10min移除石蜡，
9、以100也酉I10minX2,空气干燥10min,从高到低梯度乙醇(95%80%70%)1min/每个浓度。PBs5minX3,孵育在2XSSc10min。(3)离心细胞涂片：将细胞先以4族聚甲醛固定，应用离心沉淀法，将沉淀物涂于有粘附剂的载片上， 应用PBS(含5mmol/lMgCl2)5minX3漂洗。 在0.1mol/L三乙醇胺含0.25%(V/V)乙酸酊10min。 在0.2mol/lTrisHCl含(0.1mol/L甘氨酸)pH7.410min。孵育在2XSSc10min。2 .探针准备35pmol的寡核昔酸(oligo-)探针，3终末标记以地高辛-11dUTR3 .预杂交和杂交加约
10、300Ml预杂交液(配制法见附录)在每张载片上，室温孵育1h。如为鲜鱼精子DNA在应用前须在沸水浴中加热10min,而对酵母tRNA可不用加热变性。(1)应用预杂交液稀释地高辛标记的Oligo-探针，探针理想工作浓度根据于待测核音酸含量和实践的结果。如对于检测大鼠垂体的前促黑激素(proopiomelanocortin,POMC)mRNA勺Oligo-探针，其理想工作浓度为342ng/ml(0.342ng/gl)。(2)预杂交后以2XSSC漂洗，以吸水纸拭干切片周围水份，加30gl杂交液在切片上，加硅化盖玻片，在37c过夜。如探针大于36碱基则杂交温度为42Co次日室温2XSSC液漂洗切片1h
11、,1XSSC漂洗切片1h(室温)，0.5XSSc37c洗半小时，0.5XSSC室温漂洗半小时。4 .地高辛显示。地高辛标记cRNAS针1 .组织前处理在组织制片中以冷冻切片(厚10302最佳。切片贴在预先清洁，高温处理并涂以粘附剂载玻片上，先在37c预干燥4h,然后置于37c烤箱中过夜。经过上述处理的切片如在-20C可保存23周，在-70C可保存数月之久，有报告可保存数年之久的。但仍以新鲜制片为好。如为石蜡包埋切片，应脱蜡经梯度酒精入水。一般不提倡浸入二甲苯溶液。但在细胞内mRN给量高时应用二甲苯脱蜡后仍能显示。经水洗后入37c烤箱4h或过夜，然后进行杂交前处理。在烘烤及低温保存时，为防尘埃及
12、空气中RNA酶的污染，宜用锡箔纸(foilpaper)包被，内加少许干燥剂(变色硅胶)。下列步骤所需玻璃器皿均需消毒，操作者需戴手套。(1) PBS洗2X3min。(2)选择少数几张切片作为“RNA酶对照片”。其它切片暂放于PBs内。RNAB对照片处理方法：加RNAB(100Rg/ml)在预热37c的溶液内。放在潮湿的盛有少许2XSSC塑料盒或蒸发皿内。在每张切片上覆以过量的RNA酶溶液，在37c孵育30min后用2XSSC冲洗，2X3min,然后与其它保存在PBS的切片一起进行下列处理。(3)蛋白酶K消化：将组织切片放在0.1mol/lTris/50mmo/LEDTApH8.0,内含蛋白酶K
13、1gg/ml,孵育1520min。消化时间应根据组织的种类，厚度反复试验调整。时间过短探针不易进入，过长影响细胞或组织的形态结构。(4)0.1mol/L甘氨酸/PBs5min终止蛋白激酶K反应。0.25%乙酸酊(0.1mol/l三乙醇胺配制)10min。(5)在4族聚甲醛/PBS3min。(6)以PBs漂洗2X3min。(7)浸入新鲜配制的0.25%乙酸酊(0.1mol/L三乙醇胺配制)10min,以封闭非特异性结合部位。(8) 2XSSC漂洗15min。2 .杂交以含cRNA探针(0.5ng/ml)的杂交液， 按每张切片1026的量覆盖切片。 地高辛配基标记的cRNA核酸探针保存浓度为2.5
14、ng/ml,用前稀释备用。覆以硅化盖玻片或塑料蜡膜，置于盛有少量2XSSC温盒内在42C,1618h或过夜。3.显示(1)用缓冲液1冲洗杂交后的载片2X3min。(2)在缓冲液1中10min,室温以封闭非特异性结合部位。(3)拭干切片周围的载片，注意保持切片湿润。加数滴抗地高辛抗血清(工作浓度1:500,以缓冲液1稀释)，孵育2h,室温。(4)缓冲液1漂洗3X3min。(5)浸入缓冲液210min室温。(6)浸入底物中孵育1030min(或更长时间，视需要而定)，底物内含显色BCIP/NBT,室温。最好用锡箔纸包裹反应盒，使显色在黑暗中进行。定期取出切片在显微镜下检测反应强度。根据反应强度决定
15、延长或终止反应。反应颜色为紫蓝色。(7)将切片浸入缓冲液3以终止反应。(8)复染，可用1%尹红、1砌木精、1%g绿或5%勺焦宁(又称派咯宁Y)(pyroninY)1030s。(9)流水洗510min,直至水无色为止。(10)在切片未干前，以PBS/甘油封固切片，如要永久保存，可以用DPX在盖片四周封固。为去除水份，在封固前可进行梯度酒精脱水，透明，DPX封固，但每步时间仅需几秒钟，时间过长易致褪色。原位杂交实验步骤1质粒的转化和扩增1.1制备XL1-Blue感受态细菌1 .取400uLXL1-Blue菌种加入到含200mlLB培养基的锥形瓶中，37C、100rpm培养4h,离心，倒置，以冰冷的
16、0.1mol/LCaCl_2重悬细菌，冰浴30min,离心，弃上清，倒置，再加4ml(含15%甘油)冰冷的CaCl2重悬细菌，分装(200g/tube),-80C保存。2 .转化：在冰浴中将1管XL1-Blue感受态菌解冻，将浓度为2ng/g1的质粒DNA4g1加入到80M1感受态菌中。3 .轻轻摇匀，冰浴30min。4 .42C热激9O秒，然后迅速冰浴2min。5 .加入LB培养液(无氨苇青霉素)0.8ml,在37C,100转/min水浴孵育60min。6 .取200Ml菌液铺于琼脂板上(涂有X-Gal(20mg/ml)-IPTG(200mg/ml)的LB-氨苇青霉素50mg/ml,1“l/
17、ml培养基)，待菌液全部被吸收后，倒置平板于37C培养12-16h。1.2鉴定和挑选含重组质粒的菌落1 .用无菌牙签挑取单菌落，接种到10ml含氨苇青霉素的LB培养液的离心管中，于37C,200转/分培养2h,取1ml之一Eppendorf离心管,力口50”l10mmol/LEDTA(pH8.0)。2 .加入506新配置的0.2mol/LNaOH0.5%SDS20%蔗糖溶液后，振荡3O秒。3 .在70c温育5min,然后冷却到室温。4 .加1.51114mol/LKCl和0.5g1含0.4%溟酚兰染液，振荡3O秒后，冰浴5min。5 .12000g,4C离以3min,以除去细菌碎片。6 .制备
18、1%的琼脂糖凝胶(含EB0.5gg/ml),取50gl上清液加入到样品孔中，其中一孔加入中等分子量DNAMarker。恒压50V,进行电泳。7 .当溟酚兰迁移到凝胶全长的2/3-3/4时，停止电泳，在紫外灯下检查质粒DN砌于量的大小是否与转入质粒相符。1.3质粒的扩增和纯化1 .用无菌牙签分别挑取单个白色菌落移入含30mlLB-氨苇青霉素(50“g/ml)培养液的聚丙烯管中，于37,200转/分培养3ho2 .将菌液转入含70mlLB-氨苇青霉素培养液的250ml锥形并中，37,200转/分培养过夜(12-16h),细菌浑浊。3 .菌液中加入氯霉素液(34mg溶于lml乙醇，100ml菌液加入
19、0.5ml氯霉素溶液，终浓度为170从/ml)。37,200转/分培养12-16h。4 .将培养的细菌倒入50ml的离心管中，6000rpm,4C离，th,15min，沉淀细菌。5 .弃净上清夜，用2ml预冷的溶液I,悬浮菌体沉淀，剧烈振荡，于室温静置5min6 .加入新配制的溶液II4ml，快速用手晃动10秒，颠倒数次后，于室温静置10min。7 .加入预冷的溶液III3ml,温和振荡l0秒，于冰上静置10min,出现白色絮状沉淀。8 .6000rpm,4C离心15min,保留上清。9 .将上清(若带细菌残片， 则再次离心)移入另一50ml的离心管中， 加入O.6倍体积的异丙醇混匀， 于室温
20、静置10min。(或-20C4h,或4C过夜，可便核酸沉淀)10.12000rpm,4C离心15min,回收核酸。小心弃去上清，倒置离心管使残兼上清液流尽。11 .于室温用70%的乙醇洗涤沉淀物和管壁，室温12000rpm离心，15min,充分弃去乙醇，于室温将离心管倒置在纸巾上，使最后残余的痕量乙醇挥发殆尽。12 .用500glTE(pH8.0)溶解核酸沉淀，转移至1.5mlEppendorf管中。13 .加入用冰预冷的5mol/L的LiCl溶液6006，充分混匀。12000rpm,4C离心15min,以沉淀高分子量的RNA14.将上清转移到另一1.5mlEppendorf管中，加等量异丙醇
21、，充分混匀，于室温静置10min。15.12000rpm,4C离心15min,回收核酸。小心弃去上清，倒置离心管使残余上清液流尽。16.于室温用70%的乙醇洗涤沉淀物和管壁，室温12000rpm离心，15min,充分弃去乙醇，于室温将离心管倒置在纸巾上，使最后残余的痕量乙醇挥发殆尽。17.40011l含无DNA酶的RNA酶(20gg/ml)的TE缓冲液(pH8.0)溶解沉淀，将溶液转移到另1.5mlEppendorf管中，室温放置1.5mlEppendorf管中30min。18,加入400iil13%(v/v)的PEG8000-NaCl(1.6mol/L),混匀，4C12000rpm离心5mi
22、n以回收质粒DNA弃去上清。19.加入400MlTE缓冲液(pH8.O)溶解沉淀，再分别用等体积的Tris饱和酚、酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)、和氯仿各抽提一次。20 .将水相(上清)移入另一1.5mlEppendorf管中， 加入O.1体积(约50M13M的醋酸钠(pH5.2)和2倍体积(大约1ml)的无水乙醇，充分混匀后于4c放置30min。21.于4c12000rpm离心5min回收沉淀的质粒DNA尽可能弃去上清，敞开管口，置工作台上使残留的痕量乙醇蒸发殆尽。22 .加入400gl处于4C的70%乙醇，稍加振荡，漂洗沉淀，412000rpm离心2min。23 .吸去上清，室温敞开管
23、口，直到乙醇完全挥发。24 .用100MlTE缓冲液(pH8.0)溶解沉淀。25 .取4gl溶液1:100稀释后，测定其OD260OD28Q以确定质粒DNA勺纯度和浓度(OD260/D2801.8。OD260/OD280寸DNAM言其值大约为1.8,高于2.0则可能有RNA污染，低于1.8则有蛋白质污染。；DNA浓度=OD260X0.05X稀释彳数(iigXill)。26 .质粒DNA容液于-20C保存待用。二、cRNAB针的标记1 .将质粒DNA用相应的限制性内切酶线性化，通过琼脂糖凝胶电泳以确保完全线性化。2 .线性化后的DNA按“质粒的纯化”步骤19-24进行纯化， 作为cRNA探针标记
24、的模板， 用相应的RN课合酶合成地高辛标记的反义和正义RNAB针。3 .进行体外转录，步骤如下：4 .在冰上将各试剂加入一1.5ml无RNA酶的Eppendorf管中。DEPO理的三蒸水8al质粒DN砥板0.05gg/gl1gl10 xNTP地高辛标记混合物1x2gl0.1MDTT溶液10mM2gl5x转录缓冲液1x4glRNAse卬制齐I12U/Rl1glRN课合酶2U/“l2gl反应体系总体积20gl5 .加入上述各试剂后，混匀，简短离心后在37C孵育2h。6 .加入2Rl无RNA酶的DNA酶I(10U/g1),37C孵育15min降解模板DNA7 .加入0.2MEDTA(pH8.0)溶液
25、2m终止反应。8 .加入2.5Rl的4MLicl和7.5从l冷的无水乙醇，混匀，-20C放置2h。9 .12000g下离以15min,弃上清，小心地用506冷的70%乙醇洗涤沉淀。10 .室温下稍干燥，溶于100g1DEPC处理过的三蒸水中，混匀分装，-20C下保持备用。三、原位杂交3.1冰冻切片与杂交前预处理1 .将子宫样品从-80C取出，用OCT包埋，在-23C（切片机腔体温度）平衡至少30min。将包埋好的样品固定在样品头上，切10Mm厚的连续组织切片，平铺于涂有多聚赖氨酸（1mg/m1）的玻片上（玻片预先经180C干烤6小时），保存于-70C冰柜备用。2 .冰冻切片经室温干燥10min后，在4%的多聚甲醛-PBS（pH7.4）固定lOmin。3 .活跃的DEPC-PBS卡高压的0.1%DEPC-1XPBS液）洗2次，每次5min。4 .在0.2M的盐酸作用中作用10min后，重复步骤4）。5 .在切片上滴加蛋白酶K（0.1”g/m1）,37C孵育15min,重复步骤4）。6 .经0.1MTEA（三乙醇胺） 作用5min后， 再
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