原位杂交是指将特定标记的已知顺序核酸为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交，从而对特定核酸顺序进行精确定量定位的过程。原位杂交可以在细胞标本或组织标本上进行。
原位杂交实验操作步骤：
（一）取材、冰冻切片：
将动物以3%戊巴比妥钠麻醉，打开胸腔，暴露心脏，刺破右心耳，将针尖刺入左心室用生理盐水灌注（灌注量约为动物体重的2倍），再注入等量的4%多聚甲醛。取材，置于4%多聚甲醛中后固定4hr。以0.1MPBS浸泡冲洗4-5次（换液：1次/hr）。将组织块入30%蔗糖/0.1MPBS液（4℃），1-2天后冰冻切片，将切片裱贴于原位杂交专用玻片上，切片厚度为15-20μm。
（二）探针制备与检测（定量）：
1、随机引物制备cDNA核酸探针以DIGDNA标记检测试剂盒为例：
（1）探针制备：
① 模板DNA（0.5-3μg）15μl，100℃变性10min，冰浴5min。
② 在冰浴中加：Hexanucleotidemix2μl，dNTPmix2μl，KlenowEnzyme1μl，反应总体积为20μl。37℃孵育过夜。
③ 在上述20μl的标记产物中加4MLiCl2.5μl，75μl（无水乙醇预冷，轻轻混匀，-20℃放置2h。4℃离心12000g×15min，弃上清。70%乙醇（预冷）50μl洗涤，7500g×5min，弃上清，晾干沉淀，加TE50μl溶解沉淀，-20℃保存备用。
（2）探针敏感性检测：
① 样品稀释：取dig-标记探针1μl用ddH2O以1：10、1：100、1：1000、1：1000、1：10000梯度稀释。
② 取一张与点样器大小相近的尼龙膜，标记方向，ddH2O中浸泡1min，6×SSC中浸泡10min，置点样器上，负压抽吸5min。
③ 将上述样品点于尼龙膜上，继续抽吸10min。
④ 取下尼龙膜，置紫外灯下10cm处照射5min，晾干。
⑤ 将膜置于适量预杂交液（5-10ml）中，37℃预杂交10min。
⑥ 加入Anti-dig抗体（1：5000），37℃杂交30min。
⑦ 洗膜：2×SSC/0.1%SDS室温洗10min×2次。
⑧ 显色：15mlTSM2中加300μl显色液（NBT/BCIP），37℃避光显色30min。
2、PCR法制备cDNA核酸探针：
（1）探针制备：
以PCRDIGProbeSynthesisKit为例：
在0.5ml离心管中，依次加入：
PCR引物1（10pM）2μl；
PCR引物1（10pM）2μl；
质粒DNA模板（10-100pg）2μl；
PCRDIGmix2μl（含dNTP和DIG-11-dUTP）；
dNTPmix2μl；
10×PCRbuffer5μl；
Taq酶（2u/μl）1μl；
加入适量ddH2O，使总体积达50μl。
① 将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。
一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃45s→58℃45s→72℃60s，循环30-35次，最后在72℃保温7min。
② 在上述PCR产物中加入4MLiCl12.5μl、预冷无水乙醇375μl，轻轻混合后置于-20℃2h，12000g×15min，弃上清。70%乙醇（预冷）120μl洗涤沉淀，离心7500g×5min，弃上清，晾干沉淀，加TE50μl溶解，-20℃保存备用。
（2）探针检测：
行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察DIG-DNA探针含量（采用目测法）。
（三）原位杂交反应（以DIG-cDNA探针为例）：
1、0.1MPBS（pH7.2）浸5-10min。
2、0.1M甘氨酸/0.1MPBS浸5min。
3、0.3%TritonX-100/0.1MPBS浸10-15min。
4、0.1MPBS洗5min×3次，加蛋白酶K（1μg/ml），37℃孵育30min。
5、4%多聚甲醛浸5min。
6、0.1MPBS洗5min×2次，浸入新鲜配制的含0.25%乙酸酐/0.1M三乙醇胺中10min。
7、预杂交：滴加适量预杂交液，42℃30min。
（1）杂交：倾去预杂交液，在每张切片上滴加10-20μl杂交液（将探针变性后稀释在预杂交液中，0.5ng/μl），覆以盖玻片或蜡膜，42℃过夜。
（2）洗片：
4×SSC、2×SSC、1×SSC、0.5×SSC37℃各洗20min；
0.2×SSC37℃洗10min；
0.2×SSC与0.1MPBS各半洗10min；
0.05MPBS洗5min×2次。
8、3%BSA/0.05MPBS包被，37℃30min。
9、滴加抗地高辛-抗血清碱性磷酸酶复合物（以抗体稀释液1:5000稀释）4℃孵育过夜。
10、0.05MPBS洗15min×4次；TSM110min×2次；新鲜配制TSM210min×2次。
11、显色：在玻片上滴加适量显色液，4℃避光过夜。
12、将玻片置于TE中10-30min以终止反应。酒精梯度脱水、二甲苯脱脂，中性树胶封片。