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1、生物科学与工程系生物化学教研室,实验四 血清蛋白的醋酸纤维素薄膜电泳,生物科学与工程系生物化学教研室,实验目的,1.掌握电泳法分离蛋白质的原理、操作方法。 2.了解电泳法分离蛋白质的临床意义。,生物科学与工程系生物化学教研室,醋酸纤维素薄膜： 醋酸纤维素（二乙酸纤维素）薄膜具有匀一的泡沫状结构，渗透性强，对分子移动无阻力，用它作区带电泳的支持物，具有用样量少，分离清晰，无吸附作用。目前可用于血清蛋白、脂蛋白、糖蛋白、酶的分离和免疫电泳等方面。 醋酸纤维素薄膜经1,4二氧六环、透明液或液体石蜡处理即透明，因而可得背景为无色的电泳图谱。,生物科学与工程系生物化学教研室,实验原理,电泳:带电质点在电
2、场中向本身所带电荷相反的电极移动的现象。在一定pH条件下，不同的质点由于等电点不同而带不同性质的电荷，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，即它们的电泳迁移率不同，因此可使它们分离。 影响电泳迁移率的外界因素：电场强度、溶液的pH值、溶液的离子强度和电渗现象。 影响电泳迁移率的内在因素：质点所带净电荷的量、质点的大小和形状。 醋酸纤维素薄膜电泳具有微量、快速、简便、分辨力高，对样品无拖尾和吸附现象等优点。,生物科学与工程系生物化学教研室,采用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法称为醋酸纤维素薄膜电泳。醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化所形成的纤维素醋酸酯，将它溶于有机溶剂（如：丙酮、氯仿、
3、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状的结构，厚度约为120m，有很强的通透性，对分子移动阻力很小。 本实验以醋酸纤维素为电泳支持物，分离各种血清蛋白。血清中含有清蛋白、-球蛋白、-球蛋白、-球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氨基酸组成、分子量、等电点及形状不同，在电场中的迁移速度不同。以醋酸纤维素薄膜为支持物，正常人血清在pH8.6的缓冲体系中电泳，染色后可显示5条区带。其中清蛋白的泳动速度最快，其余依次为1-、2-、-及-球蛋白,生物科学与工程系生物化学教研室,血清蛋白,生物科学与工程系生物化学教研室,实验器材及试剂,一、器材： 醋酸纤维素薄膜
4、（2cm8cm）、培养皿、滤纸、无齿镊、剪子、加样器（可用盖玻片或X胶片或微量加样器）、直尺、铅笔、玻璃板（8cm12cm）、烧杯、试管、试管架、吸管、电泳仪、电泳槽。,生物科学与工程系生物化学教研室,二、试剂,1、巴比妥缓冲液(pH8.6，0.07mol/L，离子强度0.06)：称取巴比妥钠12.76g、巴比妥1.66g，加500毫升蒸馏水，加热溶解。待冷至室温后，再加蒸馏水至1000毫升。 2、氨基黑10B染色液：称取氨基黑10B0.5g加入冰醋酸10ml、甲醇50ml,混匀，加蒸馏水至100ml。 3、漂洗液:甲醇45ml、冰醋酸5ml，混匀后加蒸馏水至100ml。 4、洗脱液:0.4
5、mol/L NaOH溶液。 5、透明液:称取柠檬酸21g，N-甲基-2-吡咯烷酮150g，以蒸馏水溶解并稀释至500ml。,生物科学与工程系生物化学教研室,实验步骤,1.准备 将缓冲液加入电泳槽的两槽内，并使两侧的液面等高。裁剪尺寸合适的滤纸条，叠成四层贴在电泳槽的两侧支架上，一端与支架前沿对齐，另一端侵入电泳槽的缓冲液内，使滤纸全部湿润，此即“滤纸桥” 。,1：滤纸桥 2：电极缓冲液 3：醋酸纤维素薄膜,生物科学与工程系生物化学教研室,将醋酸纤维素薄膜切成2cm8cm大小，在无光泽面的一端约1.5cm处，用铅笔轻划一直线，作为点样位置。然后将无光泽面向下，置于盛有巴比妥缓冲液的培养皿中浸泡，
6、待充分浸透（约20min）即无白色斑点后取出，用洁净滤纸轻轻吸去表面的多余缓冲液。,生物科学与工程系生物化学教研室,2. 点样,用加样器取少量血清(约23l)，加在点样线上，待血清渗入膜内，移开加样器。点样时应注意血清要适量，应形成均匀的直线，并避免弄破薄膜.,生物科学与工程系生物化学教研室,3.平衡与电泳 将点样后的薄膜有光面朝上，点样的一端靠近负极，平直地贴于电泳槽支架的滤纸上，平衡约5分钟。盖上电泳槽盖，通电进行电泳。调节电压为100160伏，电流0.40.6mA/cm宽，夏季通电45分钟，冬季通电60分钟，待电泳区带展开2.53.5cm时断电。 4.染色 用无齿镊小心取出薄膜，浸于染色
7、液中13分钟（以清蛋白带染透为止）。染色过程中应轻轻晃动染色皿，使薄膜与染色液充分接触，薄膜量较多时，应避免彼此紧贴而影响染色效果。,生物科学与工程系生物化学教研室,5.漂洗 准备3个培养皿，装入漂洗液。从染色液中取出薄膜，依次在漂洗液中连续浸洗数次，直至背景无色为止。将漂净的薄膜用滤纸吸干，从正极端起依次为清蛋白（A）、1、2、及-球蛋白。,生物科学与工程系生物化学教研室,6. 定量 （1）洗脱法：取6支试管，编号，分别为A、1、2、和空白管。于清蛋白管加入0.4mol/L NaOH溶液4ml,其余5管加2ml。剪下各条蛋白区带，另于空白部分剪一条与各蛋白区带宽度近似的薄膜作为空白，分别浸入
8、各管中，振摇数次，置37水浴20分钟，使色泽完全浸出。用620nm波长以空白管调零比色，读取各管吸光度，按下式计算： T=A2+1+2+ 清蛋白%清蛋白管吸光度2/T100 1-球蛋白%1-球蛋白管吸光度/T100 2-球蛋白%2-球蛋白管吸光度/T100 -球蛋白%-球蛋白管吸光度/T100 -球蛋白%-清蛋白管吸光度/T100,生物科学与工程系生物化学教研室,（2）扫描法： 待染色的醋酸纤维素薄膜完 全干燥，置透明液中约3分钟，取出贴于玻片上，薄膜完全透明。将已透明的薄膜放入全自动光密度计中，对蛋白区带进行扫描，自动绘出电泳图，并直接打印出各区带的百分含量。,生物科学与工程系生物化学教研室
9、,临床意义：,急慢性肾炎、肾病综合征、肾功能衰竭时，清蛋白降低，1、2和-球蛋白升高； 慢性活动性肝炎、肝硬化时，清蛋白降低，、-球蛋白升高； 急性炎症时，1、2-球蛋白升高；慢性炎症时，清蛋白降低，2、-球蛋白升高； 红斑狼疮、类风湿关节炎时，清蛋白降低，-球蛋白显著升高； 多发性骨髓瘤时，清蛋白降低，-球蛋白升高，于和-球蛋白区带之间出现“M”带。,生物科学与工程系生物化学教研室,注意事项,市售醋酸纤维素薄膜均为干膜片，薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一。若飘浮于液面的薄膜在1530 s内迅速润湿，整条薄膜色泽深浅一致，则此膜均匀可用于电泳。 醋酸纤维素薄膜电泳常选用pH8.6巴比妥-巴比妥钠缓冲液，其浓度为0.050.09 mol/L。缓冲液浓度过低，则区带泳动速度快,区带扩散变宽；缓冲液浓度过高，则区带泳动速度慢，区带分布过于集中，不易分辨。,生物科学与工程系生物化学教研室,点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免引起样品扩散,但不宜太干，否则样品不易进入膜内，造成点样起始点参差不起，影响分离效果。 点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏膜片或印出凹陷影响电泳区带分离效果。 电泳时电流强度一般
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