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1、实验二实验二叶绿体的分离与荧光观察叶绿体的分离与荧光观察 细胞生物学实验细胞生物学实验细胞生物学实验实验目的实验目的v1.通过植物细胞叶绿体的分离，了解细通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。胞器分离的一般原理和方法。v2.观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法。并熟悉荧光显微镜的使用方法。细胞生物学实验细胞生物学实验实验原理实验原理细胞器分离的过程包括两个主要阶段：细胞器分离的过程包括两个主要阶段：破碎细破碎细胞胞和和细胞组分的分离细胞组分的分离在等渗溶液中进行组织匀浆、分离在等渗溶液中进行组织匀浆、分离叶绿体的分离采用
2、叶绿体的分离采用差速离心差速离心或密度梯度离心法或密度梯度离心法进行进行利用荧光显微镜观察叶绿体的利用荧光显微镜观察叶绿体的自发荧光自发荧光和间接和间接荧光（次生荧光（次生/诱发荧光）诱发荧光）常用的细胞破碎方法常用的细胞破碎方法方方法法技术技术 原理原理效效果果成本成本举例举例机械法匀浆法匀浆法细胞被搅拌器劈碎或细胞被搅拌器劈碎或受剪切力而破碎受剪切力而破碎适中适中适中适中动植物组织或细胞动植物组织或细胞研磨法研磨法细胞被研磨物磨碎细胞被研磨物磨碎适中适中便宜便宜植物组织植物组织超声波法超声波法用超声波的空穴作用用超声波的空穴作用使细胞破碎使细胞破碎剧烈剧烈昂贵昂贵细胞悬浮液小规模处理细胞悬
3、浮液小规模处理珠磨破碎法珠磨破碎法细胞被玻璃珠或铁珠细胞被玻璃珠或铁珠捣碎捣碎剧烈剧烈便宜便宜细胞悬浮液和植物细胞细胞悬浮液和植物细胞大规模处理大规模处理化学法渗透冲击渗透冲击渗透压破坏细胞渗透压破坏细胞温和温和便宜便宜血红细胞的破坏血红细胞的破坏酶消化法酶消化法细胞壁或细胞膜被消细胞壁或细胞膜被消化，使细胞破碎化，使细胞破碎温和温和昂贵昂贵动植物细胞动植物细胞增溶法增溶法表面活性剂溶解细胞表面活性剂溶解细胞膜膜温和温和适中适中破碎大肠杆菌破碎大肠杆菌脂溶法脂溶法有机溶剂溶解细胞壁有机溶剂溶解细胞壁适中适中便宜便宜甲苯破碎酵母细胞甲苯破碎酵母细胞碱处理法碱处理法碱的皂化作用使细胞碱的皂化作用使
4、细胞壁溶解壁溶解剧烈剧烈便宜便宜破碎大肠杆菌破碎大肠杆菌细胞生物学实验细胞生物学实验离心分离技术离心是分离细胞组分和生物大分子最常用的分离心是分离细胞组分和生物大分子最常用的分离方法，因为不同的细胞器和分子有不同的体离方法，因为不同的细胞器和分子有不同的体积和密度，可在不同离心力不同介质沉降分离。积和密度，可在不同离心力不同介质沉降分离。分离各种细胞组分的方法主要有：分离各种细胞组分的方法主要有：差速离心差速离心 密度梯度离心密度梯度离心 l速率速率-区带梯度离心区带梯度离心 l等密度离心等密度离心细胞生物学实验细胞生物学实验差速离心 主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。起主
5、要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。起始的离心速度较低，让较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍然悬始的离心速度较低，让较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍然悬浮在上清液中。收集沉淀，改用较高的离心速度离心悬浮液，将浮在上清液中。收集沉淀，改用较高的离心速度离心悬浮液，将较小的颗粒沉降，以此类推，达到分离不同大小颗粒的目的。较小的颗粒沉降，以此类推，达到分离不同大小颗粒的目的。 差速离心的分辨率不高，沉降系数在同一个数量级内的各种粒子差速离心的分辨率不高，沉降系数在同一个数量级内的各种粒子不容易分开，常用于其他分离手段之前的粗制品提取不容易分开，常用于其他分离手段之前的粗制品提取 细胞生
6、物学实验细胞生物学实验密度梯度离心密度梯度离心用一定的介质在离心管内形成一连续或用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞匀浆液混悬不连续的密度梯度，将细胞匀浆液混悬或置于介质的顶部，通过重力或离心力或置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞器分层、分场的作用使细胞器分层、分离的方法。离的方法。这类分离又可分为这类分离又可分为速速率率- -区带梯度离心区带梯度离心和和等密度等密度梯度离心梯度离心两种。两种。优点是一次离心可优点是一次离心可分离分离提纯样品中几种提纯样品中几种组份，用于较精细的分离。组份，用于较精细的分离。细胞生物学实验细胞生物学实验速速率率- -区带梯度离
7、心区带梯度离心和和等密度等密度梯度离心梯度离心原理：原理：根据分离的粒子在梯根据分离的粒子在梯度液中度液中，通通过离心力场的作用，使不同过离心力场的作用，使不同的颗粒在密度梯度层内形成的颗粒在密度梯度层内形成一系列区带，从而达到彼此一系列区带，从而达到彼此分离的方法。分离的方法。A、速率、速率-区带梯度离心流程图区带梯度离心流程图B、等密度梯度离心流程图、等密度梯度离心流程图原理：原理：根据不同颗粒在密度梯度根据不同颗粒在密度梯度介质中存在着介质中存在着，在离，在离心力场作用下，颗粒或向下沉降，心力场作用下，颗粒或向下沉降，或向上浮起，一直移动到与它们或向上浮起，一直移动到与它们各自的密度恰好
8、相等的位置上形各自的密度恰好相等的位置上形成区带，从而使不同浮力密度的成区带，从而使不同浮力密度的颗粒得到分离的方法。颗粒得到分离的方法。 两种密度梯度离心方法的异同两种密度梯度离心方法的异同 特特 点点速速率率- -区带梯度离心区带梯度离心等密度离心等密度离心分离方法的主要依据分离方法的主要依据主要主要依赖依赖分离的粒子在梯分离的粒子在梯度液中度液中依赖于样品颗粒的不同密度来进行依赖于样品颗粒的不同密度来进行离心分离的离心分离的 介质密度梯度选择介质密度梯度选择 最大密度必须小于样品中最大密度必须小于样品中粒子的最小密度；梯度平粒子的最小密度；梯度平缓缓覆盖了待分离物质的密度；梯度陡覆盖了待
9、分离物质的密度；梯度陡度较高度较高 离心介质的主要作用离心介质的主要作用减缓颗粒扩散速度减缓颗粒扩散速度阻止颗粒移动；筛选与分离颗粒阻止颗粒移动；筛选与分离颗粒分辨率范围分辨率范围沉降系数相差沉降系数相差20%20%的物的物质质 颗粒密度差异大于颗粒密度差异大于1% 1% 离心后区带形成位置离心后区带形成位置易变易变( (样品易扩散）样品易扩散）不变（样品不扩散）不变（样品不扩散）影响样品区带形成的主要因素影响样品区带形成的主要因素离心时间（过长或过短都离心时间（过长或过短都不利）不利）颗粒样品密度颗粒样品密度一般操作方法一般操作方法介质梯度应预先形成介质梯度应预先形成 ，离心前将样品小心铺放
10、在离心前将样品小心铺放在密度梯度溶液表面，离心密度梯度溶液表面，离心后形成区带。后形成区带。 介质梯度不需预先制备介质梯度不需预先制备，离心时把，离心时把密度均一的介质液和样品混合后装密度均一的介质液和样品混合后装入离心管，入离心管，通过离心自形成梯度通过离心自形成梯度，让颗粒在梯度中进行再分配。让颗粒在梯度中进行再分配。常用介质常用介质蔗糖蔗糖、甘油、甘油蔗糖蔗糖 、甘油、甘油、 CsClCsCl、硫酸铯、溴、硫酸铯、溴化铯、三碘苯衍生物等。化铯、三碘苯衍生物等。 表表1:各种亚细胞构造在各种亚细胞构造在不同的离心介质不同的离心介质中分离所需的中分离所需的离心力与时间离心力与时间50% 细胞
11、核细胞核800-1000g 10min500g 10min4000g 60min 线粒体线粒体10,000g20min5000g 10min80000g100min 溶酶体溶酶体10,000g20min5000g 10min80000g100min质膜质膜(大片大片)100,000g15min100,000g100min 150,000g600min内质网片段内质网片段150,000g40min1000g20min100,000g200min微粒体微粒体100,000g60min10,000g30min100,000g360min小颗粒小颗粒100,000g60min细胞生物学实验细胞生物学实
12、验各种细胞器、大分子和病毒的各种细胞器、大分子和病毒的密度密度及相应的及相应的沉降系数沉降系数图图:各种细胞器、大分子和病毒的密度及相应的各种细胞器、大分子和病毒的密度及相应的沉降系数沉降系数 根据根据1924年年Svedberg（离心法创（离心法创始人始人-瑞典蛋白质化学家）对沉降瑞典蛋白质化学家）对沉降系数下的定义：系数下的定义：颗粒在单位离心力颗粒在单位离心力场中粒子移动的速度。场中粒子移动的速度。以每单位重以每单位重力的沉降时间表示，并且通常为力的沉降时间表示，并且通常为120010-13秒范围，秒范围，10-13这个这个因子叫做沉降单位因子叫做沉降单位S,即即1S=10-13秒秒看图
13、思考：看图思考：要将细胞匀要将细胞匀浆液中的得到更纯的分浆液中的得到更纯的分离，选用哪种离心方法离，选用哪种离心方法较好？较好？(线粒体线粒体:1.18g/ml、溶酶体溶酶体:1.12g/ml、微、微体体:1.23g/ml)细胞生物学实验细胞生物学实验离心力与离心机转速转换公式：离心力与离心机转速转换公式：图图2:离心力与离心机转数的转换列线图离心力与离心机转数的转换列线图RCF1.11810-5r(n) (g)式中式中,RCF表示相对离心力表示相对离心力,单位是重力加速单位是重力加速度度g（980厘米厘米/秒秒2）, (g)表示表示重力加速重力加速度的倍数度的倍数,r 为离心转子的半径距离，
14、指离心为离心转子的半径距离，指离心管的重心至转轴中心间的距离，单位为厘米；管的重心至转轴中心间的距离，单位为厘米；n为转子每分钟的转数（为转子每分钟的转数（rpm）。）。 为了便于进行转速和相对离心力之为了便于进行转速和相对离心力之间的换算，人们在此公式的基础上间的换算，人们在此公式的基础上制作了离心力的列线图。见图制作了离心力的列线图。见图2. 2. 先在离心机半径标尺上取先在离心机半径标尺上取已知的离已知的离心半径心半径和在转速标尺上取和在转速标尺上取已知的转已知的转速，速，然后在这两点间取一条直线，然后在这两点间取一条直线，与中间与中间RCFRCF标尺上的交叉点，即为标尺上的交叉点，即为
15、相应的相对离心力数值，相应的相对离心力数值，也是也是文献中常用的文献中常用的g g。 r=8cmn=15,000rpmRCF20,000g细胞生物学实验细胞生物学实验荧光荧光荧光显微镜观察荧光显微镜观察荧光现象：荧光现象：某些物质在一定短波长的光（如紫外光）的照射下某些物质在一定短波长的光（如紫外光）的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光（如在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光（如可见光），这种光就称为可见光），这种光就称为荧光荧光。若停止供能，荧光。若停止供能，荧光现象立即停止。现象立即停止
16、。有些生物体内的物质受激发光照射后，可直接发出有些生物体内的物质受激发光照射后，可直接发出荧光荧光,称为称为自发荧光自发荧光。如叶绿素的火红色荧光。如叶绿素的火红色荧光。有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光，称为同样也能发出荧光，称为间接荧光间接荧光。如叶绿体吸附。如叶绿体吸附吖啶橙吖啶橙后可发橘红色荧光。后可发橘红色荧光。1.两组光源:透射照明光源(卤素灯)；荧光光源(超高压直流汞灯或氙灯)；2.有特殊的滤光片:3.激发光波长：较短，因此，分辨力高于普通显微镜；4.荧光光源荧光光源照明方式：通常为落射式。紫外光紫外光(UV)
17、：激发光谱区域：激发光谱区域：330-400nm; 紫光紫光(V)：激发光谱区域：激发光谱区域：395-415nm;蓝光蓝光(B)：激发光谱区域：激发光谱区域：420-485nm;绿光绿光(G)：激发光谱区域：激发光谱区域：460-550nm ；荧光显微镜的荧光显微镜的 特特点：点：图：落射式荧光显微镜的光路图：落射式荧光显微镜的光路细胞生物学实验细胞生物学实验荧光染料荧光染料:吖啶橙吖啶橙(acridine orange ) 吖啶橙是一种与吖啶橙是一种与DNA和和RNA都能结合的荧光染料都能结合的荧光染料 在在紫外光或蓝光紫外光或蓝光(330485nm)激发下，激发下，DNA可被激发可被激发
18、出出530nm的荧光发射峰的荧光发射峰(细胞核发细胞核发亮亮绿色荧光绿色荧光)，RNA可被激发出可被激发出640nm的荧光发射峰的荧光发射峰(核仁和胞质核仁和胞质RNA发发桔桔红色荧光红色荧光)。 产生两种不同荧光是由于产生两种不同荧光是由于吖啶橙吖啶橙与双链与双链DNA 和单链和单链DNA或或RNA的的结合方式和结合量不同结合方式和结合量不同而决定的。而决定的。DNA是高度聚合物，它与是高度聚合物，它与DNA结合是潜入双链之间，结合结合是潜入双链之间，结合量相对少；而与单链量相对少；而与单链DNA或或RNA的结合则由静电吸引的结合则由静电吸引堆积在磷酸根上，结合量相对多些。堆积在磷酸根上，结
20、灭的。的。荧光淬灭荧光淬灭：在产生荧光的物质的溶液中加入盐等物质会使：在产生荧光的物质的溶液中加入盐等物质会使溶液的吸光度下降而荧光强度变小的现象。溶液的吸光度下降而荧光强度变小的现象。荧光淬灭现象产生原因荧光淬灭现象产生原因：分子结构和化学环境是影响物质：分子结构和化学环境是影响物质发射荧光和荧光强度的重要因素（发射荧光和荧光强度的重要因素（pH、温度、光、淬灭剂）.细胞生物学实验细胞生物学实验 实验用品实验用品 材料材料： 菠菜叶片菠菜叶片 试剂试剂：蒸馏水，蒸馏水，0.35mol/L0.35mol/L氯化钠溶液，氯化钠溶液，0.01%0.01%吖啶橙吖啶橙( (AO)AO) 仪器仪器：普
21、通离心机，组织捣碎机，天平，荧光显微镜，：普通离心机，组织捣碎机，天平，荧光显微镜，显微镜，镊子，培养皿，纸，移液管，滴管，烧杯，无显微镜，镊子，培养皿，纸，移液管，滴管，烧杯，无荧光载片，盖玻片，离心管荧光载片，盖玻片，离心管, ,吸水纸等吸水纸等配制方法：配制方法：称取称取0.1g0.1g吖啶橙加蒸馏水吖啶橙加蒸馏水100ml100ml做干液，放冰做干液，放冰箱备用，临用前取箱备用，临用前取1ml1ml干液加干液加1/15mol/L1/15mol/L磷酸缓冲液磷酸缓冲液（pH4.8pH4.8）9ml9ml。细胞生物学实验细胞生物学实验 菠菜叶片菠菜叶片(去叶脉去叶脉)3g 0.35mol/
22、L氯化钠氯化钠15ml研磨研磨(冰浴冰浴)匀浆过滤匀浆过滤(2层尼龙网层尼龙网)滤液在滤液在1000rpm离心离心2min弃沉淀，上清液弃沉淀，上清液3000rpm离心离心5min 去上清液去上清液沉淀为叶绿体沉淀为叶绿体(混有部分细胞核混有部分细胞核)，用，用0.35mol/L氯化钠氯化钠溶液悬浮溶液悬浮 滴片观察滴片观察 取叶绿体悬液取叶绿体悬液1滴置于载玻片上，加盖玻片后用分别用滴置于载玻片上，加盖玻片后用分别用普通普通光学显微镜观察叶绿体的形态结构光学显微镜观察叶绿体的形态结构和和荧光显微镜观察自发荧光显微镜观察自发荧光荧光 将叶绿体悬液滴在无荧光的载玻片上将叶绿体悬液滴在无荧光的载玻
23、片上, ,再滴加再滴加1 1滴滴0.01%0.01%吖啶吖啶橙荧光染料橙荧光染料，盖上无荧光的盖玻片，盖上无荧光的盖玻片, ,使用使用荧光显微镜荧光显微镜观察观察间间接荧光接荧光 取叶表皮临时装片荧光染色观察取叶表皮临时装片荧光染色观察 实验步骤实验步骤细胞生物学实验细胞生物学实验实验结果实验结果普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄型，在高普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄型，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色颗粒，倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色颗粒，即基粒。即基粒。荧光显微镜下，选用荧光显微镜下，选用蓝色激发滤光片蓝色激发滤光片，叶绿体自，叶绿体自发荧光为火红色，间接荧光为桔红色。细胞核呈发荧光为火红色，间接荧光为桔红色。细胞核呈黄绿色。黄绿色。图：图：叶绿体自发荧光为火红色叶绿体自发荧光为火红色细胞生物学实验细胞生物学实验细胞生物学实验细胞生物学实验 叶绿体的分离应在等渗溶液叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L(0.35mol/L氯化钠氯化钠) )中进行中进行,
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