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当期封面。受访者供图
2016年1月，回国不满半年的张余，在《中国科学院分子植物科学卓越创新中心人员遴选申请书》里写道：“申请人拟开展的工作是运用结构生物学研究叶绿体编码的RNA聚合酶（PEP）的工作机理和调控机制。”
8年后，张余团队和华中农业大学副教授周菲团队合作，解析了PEP的冷冻电镜结构，并揭示了该叶绿体基因转录“机器”的“装配部件”“装配模式”“功能模块”，为叶绿体光合作用的基础研究和应用探索打下了基础。相关研究成果3月1日以封面文章形式发表于《细胞》。
“植物学领域的前沿科学问题，很多都是生命科学的共性问题。”中国科学院院士、中国科学院分子植物科学卓越创新中心（以下简称分子植物卓越中心）主任韩斌告诉《中国科学报》，这项工作填补了RNA聚合酶（RNAP）领域的空白，是可以写进教科书的突破性进展，将带动后续一系列应用方面的探索。
领域里最有挑战性的难题
如果将细胞比作一台精密运转的电脑，基因转录机器——RNAP则是转录过程中的“中央处理器（CPU）”，其重要性不言而喻。“遗传信息被存储在基因组这块‘硬盘’中，必须借助‘CPU’读取细胞中的各类数据，并整合各方信号输出指令，才能开始后续的生命活动。”张余解释。
随着对此类“CPU”认识的不断深入，人们惊奇地发现，尽管生物种类繁多，RNAP却十分保守。
几十年间，科学家陆续解析了细菌、古菌、真核生物RNAP的结构和工作机制。但对植物特有RNAP的解析进展缓慢。直到近几年，张余和分子植物卓越中心研究员王佳伟才合作阐明了植物特有的Pol IV结构和机制。而PEP结构迟迟不现“庐山真面目”。
事实上，仅PEP的鉴定发现就经历了32年。原因在于其结构过于复杂。“这是一个持续发现的过程。可能某一年发现某一蛋白是RNAP的亚基组分，过两年又发现了一个。”张余说。
植物叶绿体的“祖先”是原核蓝细菌。演化至今，叶绿体基因组变得“小而精”，转录叶绿体基因组的机器却越发复杂。PEP在原核蓝细菌基因转录机器的基础上，装配了多个独特的功能模块，“身形”变为原来的2.5倍，其“装配部件”数量变为原来的3倍。然而这些模块在原核蓝细菌中基本没有原型，大多数“借”于真核细胞。
多年研究表明，叶绿体基因转录机器控制叶绿体的发育过程以及成熟叶绿体的基因表达，在调控植物光合作用中发挥关键作用。“PEP研究是领域内最重要、最有挑战性的。”王佳伟说。
科研是一场没有硝烟的竞争
回国后的8年间，张余团队聚焦细菌、酵母和植物的细胞核与细胞器RNAP，持续产出成果。但对于PEP的结构解析，在很长的一段时间里都没有进展。
“最大的瓶颈是如何从叶绿体中纯化丰度非常低的RNA聚合酶。我们尝试了多种手段，都以失败告终。”张余回忆，“比如我们尝试沿用解析Pol IV时的一个方法，用拟南芥悬浮细胞去纯化植物内源蛋白，但目前拟南芥中叶绿体转化的效率非常低，很难把稳定的蛋白标签插入到叶绿体基因组中。”
2019年，德国马普分子植物生理所所长、德国科学院院士Ralph Bock在分子植物卓越中心作学术报告时，介绍了其在植物质体转化技术和应用领域的研究进展。张余茅塞顿开，意识到可以在PEP的基因序列中加上一段DNA序列作为标签，再通过亲和纯化的方式，把PEP从复杂的组分中“拉”出来，从而获得叶绿体基因转录蛋白质复合物。
于是，团队锁定了叶绿体基因转化效率较高的模式植物大叶烟草。“但是前期我们没有种植烟草的经验，刚开始种植就遇到了蚜虫暴发，烟草一直长不大，我们不得不天天用透明胶带手工捕捉蚜虫。最后通过对温室和培养土灭菌才得以根治虫害。”论文第一作者、分子植物卓越中心副研究员武霄仙回忆道。
直到2022年底，团队才建立了稳定的纯化流程，突破了PEP蛋白获取瓶颈。然而，国际竞争十分激烈，陆续有几个课题组在PEP纯化及结构解析方面取得了突破。
“我们当时很紧张。”为了确保进度，武霄仙还没休完产假就回到实验室投入研究，经常做实验做到半夜。而PEP复杂的结构给数据处理带来了挑战。在获得蛋白冷冻电镜结构后，武霄仙发现PEP蛋白的二维分类中存在很多“洞”和“犄角”，三维结构也很陌生。“文献报道PEP由蓝细菌RNAP进化而来，但是我找不到一点蓝细菌RNAP的影子，一度以为自己解析了一个‘杂蛋白’。”
最终，团队从较为熟悉的亚基入手，基于前期文献和AlphaFold结构预测，将PEP亚基放置到了准确位置，并很快开始撰写论文。
2023年6月，英国Michael Webster课题组在会议中报告了白芥PEP蛋白冷冻电镜结构的相关进展。最后Webster课题组和张余团队商量“背靠背”共同发表。
“在这8年时间里，我们之所以能够坚持研究下去，得益于分子植物卓越中心营造的比较宽松、让青年人才能够潜心啃‘硬骨头’的环境。”张余强调。
补上最后一块拼图
与原核蓝细菌基因转录机器相比，PEP一共具有20个“装配部件”（蛋白亚基），其中14个是其特有的。张余团队发现，它们通过“套娃模型”进行装配：蓝细菌来源的催化模块包含6个“装配部件”，位于复合物的核心层；支架模块由7个部件组成，位于中间层，一方面可以稳定催化模块，另一方面为其他模块提供结合位点；另有7个部件位于最外层，具有不同的功能特性。
在“套娃”最外层，分布着3个不同模块：保护模块包括两个蛋白亚基，保护PEP免受叶绿体中超氧化物的氧化攻击；RNA模块包括1个亚基，能够序列特异性地结合RNA；调控模块由4个亚基组成，可能参与基因转录机器的活性调控。其中，催化模块由叶绿体基因组编码，蛋白亚基起源于蓝细菌；其他模块由细胞核基因组编码，大部分蛋白亚基起源于真核细胞，在细胞质翻译后运输至叶绿体完成组装。
“这是一个非常巧妙的组装模式，能够保证细胞核控制叶绿体的基因表达。”张余解释，“这些亚基需要在细胞核中完成转录、在细胞质中完成翻译，再运输到叶绿体中，同催化模块组装成完整的复合物，此时PEP才能够发挥功能。”
张余指出，叶绿体基因转录机器结构被解析出来，意味着三域生物所有RNA聚合酶的结构类型均被阐明，“最后一块拼图”终于被补上。
该研究在基础研究层面，为进一步探索叶绿体基因转录机器的工作模式、理解叶绿体的基因表达调控方式打下了基础；在应用层面，为改造叶绿体基因表达调控网络、增加光合作用复合物的基因表达、提高光合作用效率打下了基础；在合成生物学应用层面，则可助力重组疫苗、重组蛋白药物和天然产物的生产。
“我们只是把研究叶绿体基因转录领域的门推开了。在整个转录过程中，还有很多其他蛋白和小分子参与，需要在多个层面进一步开展研究。”张余说。