基于微藻的生物燃料因其清洁、可再生和快速生产而在环境、经济和社会层面受到关注。绿藻Chlorella vulgaris已在研究实验室和生物燃料工业中作为模式生物进行了广泛研究，以增加脂质产量，从而在商业生产中具有成本效益。
日前，香港科技大学唐本忠院士、Ryan T. K. Kwok和中国地质大学(武汉)颜能教授利用具有聚集诱导发射（AIE）特性的脂滴特异性发光剂，通过荧光成像和分选那些具有大而丰富脂滴的藻细胞进行传代培养，来增加C. vulgaris的脂质产量（图1）。具有AIE活性的TPA-A能够实时监测C. vulgaris在其生长期间的脂滴大小和数量，以便我们确定最佳收获时间。此外，通过荧光激活细胞分选（FACS）技术鉴定并收集具有高脂质含量的藻类细胞用于传代培养。与自然选择的一代相比，两次连续选择一代的脂质产量几乎翻了一番。该工作表明，AIE和FACS技术可以相联合，以提高第三代生物燃料的生产。相关工作以“Fluorescent Imaging and Sorting of HighLipid-Content Strains of Green Algae by Using an Aggregation-Induced Emission Luminogen”发表在《ACS NANO》。
图1. AIE活性发光原（TPA-A）的原理图
藻类细胞内脂滴的荧光成像
目前已经报道过了许多脂滴特异性AIEgens，它们表现出很好的生物相容性和光稳定性。然而，这些AIEgen需要多个合成步骤。因此它们相对昂贵且不易获得。在该工作中，研究者尝试使用易于得到的AIEgens对藻类中的脂滴进行荧光成像。通过实验可以发现不同水组分中TPA-A的荧光同时受到AIE和弱TICT 效应的影响（图2A）。其中，TPA-A聚集体可在紫外和蓝色区域激发，适用于 375和405 nm的普通激光。另一方面，发射光谱和激发光谱以122 nm的斯托克斯位移很好地分离，这也有利于生物成像（图2B）。为了验证 DMSO/水混合物中是否存在fw为99.9 vol%的纳米聚集体，通过光散射和TEM测量进行粒度分析。结果表明，这种溶剂混合物中的TPA-A形成了直径约为180 nm的球形纳米聚集体（图2C）。接下来，研究者使用高发射和小尺寸 TPA-A 聚集体对绿藻C. vulgaris的细胞进行染色。如图2D所示，TPA-A的绿色荧光呈球形分布在藻类细胞中。为了确认TPA-A对脂滴具有特异性，研究者使用尼罗红，一种商业脂滴探针，用TPA-A对藻类细胞进行染色。图1F所示的合并图像显示TPAA和尼罗红的共定位效率为0.88，表明TPA-A可以特异性地染色藻细胞中的脂滴。值得注意的是，在TPA-A激发条件下，藻细胞中叶绿体的荧光强度可以忽略不计（图2G），而在640 nm光照射下可观察到叶绿体的红色荧光（图2H）。与叶绿素重叠的激发和荧光光谱的尼罗红相比，TPA-A和叶绿体的完全分离的激发和发射波长使我们能够将它们应用于多通道荧光成像（图2I）以及流式细胞术分析。
图2. TPA-A的光物理性质及其在脂滴成像中的应用
藻类细胞中脂质液滴生长的实时监测
C. vulgaris的生长期约为192 h，可分为三个阶段：（1）滞后期（0-72 h），藻细胞生长缓慢；（2）对数期（72-144小时），藻细胞进入指数生长；（3）固定相 （144-192 h），其中藻类种群始终处于最大值 (图3A)。研究者收集了每个生长期（24、48、96、120、168和192小时）两个时间点的藻细胞，以监测整个生长期内脂滴的动态变化。在接种后的前24 h内，藻类细胞有许多叶绿体和脂滴（图3B）。采集细胞的荧光图像显示红色荧光点数量增加，但藻类培养48 h后未发现绿色荧光，说明藻类细胞数量增加，细胞内脂滴减少（图3C）。同时，细胞中脂滴的大小和数量不断增加，绿色荧光增强反映了这一点（图3D-E）。藻类在稳定期的早期（168 h）储存了最大量的脂滴，而在稳定期的后期（192 h）它们消耗了部分脂滴（图3F-G）。
图3. 小球藻生长不同时期脂滴的监测
藻类细胞的荧光活化细胞分选
使用流式细胞仪的FACS技术，研究者可以分离和收集具有大叶绿体和脂滴的藻类细胞，这些细胞被认为具有较高的光合和脂质生产速率。从流式细胞仪的数据分析 (图4A), TPA-A染色的C. vulgaris在固定相具有相对广泛的APC-H（叶绿体）和 DAPI-H（TPA-A）通道分布。在图4D的共聚焦图像中也可以观察到不同大小的叶绿体和脂滴。根据荧光信号的分布，将藻类细胞分为四个区域（图 4A）。分别收集DAPI-H和APC-H信号强度高的Q2区域的藻细胞和DAPI-H和 APC-H强度低的Q4区域的细胞。Q2 区域中大约96%的收集细胞被成功分离（图4B），它们的叶绿体和脂滴很大，如共聚焦图像所示（图4E）。相比之下, 在 Q4区域 (图4C) 中分离的细胞比在Q2区域 (图4F) 中的叶绿体和脂滴更小和更少。
图4. 基于TPA-A和叶绿体荧光的小球藻荧光激活细胞分选
选育提高脂质产量
根据之前的报告，研究者假设富含脂滴的藻类菌株会生长以产生更多的脂质。为了验证该假设，研究者从具有高DAPI-H信号的G1(S)分选细胞的选择性通道被命名为G2(S)（图5A）。细胞分选由FACS基于细胞的DAPI-H强度进行。上半部分作为G1(S)被收集并培养到静止期（图5B）。同样，具有高DAPI-H信号的G1(S)细胞的上半部分被收集并培养到G2(S)的静止期（图5C）。然后测量不同世代的生长和脂质生产速率。所有组的细胞浓度和生物量没有显着差异（图5D）。但G0和G2(P)之间的脂质差异微不足道（图5E）。脂质产生和脂质含量增加的原因之一可能是光合作用速率的提高。相对电子转移率从G0到G1(S)再到 G2(S)呈逐渐增加的趋势，而G0、G1(P)和G2(P)的正常通道差异很小（图5D）。
图5. 利用FACS筛选和选育高脂藻类
小结：研究者研究了一种具有AIE活性的三苯胺衍生物（TPA-A），并探讨了其在脂滴成像和高脂滴含量藻类细胞分选中的应用。在水性介质中，TPA-A被诱导形成具有强绿色荧光和高光稳定性的聚集体。TPA-A可以特异性地将C. vulgaris 中的脂滴染成绿色，进而成功地监测了C. vulgaris生长期间脂滴和叶绿体的变化，并确定了脂质收获的最佳时间。通过培养两代富含脂滴的菌株，细胞内脂质含量几乎翻倍的藻类。因此，该AIE发光剂是用于藻类研究的强大而实用的荧光探针，AIE技术可以参与其他技术，为生物燃料生产带来协同效应。
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